网站首页    玉米原生质体制备及化学转化试剂盒(20mL/T)

玉米原生质体制备及化学转化试剂盒(20mL/T)

玉米原生质体制备及化学转化试剂盒(20mL/T)
售价:
¥ 1398.00
原价: ¥1558.00
关注:0
收藏
hyypc1141-5T
数量:
  • 玉米原生质体制备及化学转化试剂盒(20mL/T

     

    货号:hyypc1141-5T     1398元

     

    产品内容:

    组份

    组分名称

    5T

    储存温度

    A

    酶解缓冲液 ECBuffer EC

    80 mL

     

     E1Enzyme 1

    1.5 g

     

     E2Enzyme 2

    0.75 g

    -20 

    BSA10%

    2.5 mL

     

    AMP100 mg/mL

    1 mL

     

    培养液 CMBuffer CM

    100 mL×3

     

    重悬液 RSBuffer RS

    15 mL

     

    B 

    转化液 TPBuffer TP 孵育液 ISBuffer IS

    18 mL

    80 mL

    RT

    还原剂

    100 µL

     

    细胞筛

    5 

     

     

    储存条件:A 盒,-20 ℃储存;B 盒,常温储存。

     

    产品简介:

    此试剂盒主要通过纤维素酶和离析酶消化植物细胞壁获得原生质体。适用于从 7-14 d 玉米幼苗中分离原生质体。获得的原生质体可用于蛋白的亚细胞定位,验证蛋白间的相互作 用,转录因子的转录调控等。本试剂盒包含原生质体制备和转化需要的全部试剂,按照每次 20 mL 酶解液的使用量,可供 5次原生质体制备以及 120 个转化反应。

    使用说明:

     

    一、准备工作

    1.  需要自行准备的材料:

    锋利刀片;血球计数板;50 mL 离心管;2 mL 离心管,切过尖的灭菌蓝枪头和黄枪头、 10 μL白枪头(进口的更佳)。

    2.酶解液配置

    配制顺序       组分                                         20 mL 体积

     

     

    第一步

    酶解缓冲液 EC

     E1Enzyme 1  E2Enzyme 2

    16 mL 0.3 g   0.15 g

    第二步

    混匀后 55 ℃水浴 10 min ,期间颠倒混匀 2-3 次, 冷却室温后加入以下成分

     

     

    第三步

    BSA10% 还原剂

    Amp100 mg/mL

    200 µL  7. 14 µL 10 µL

    第四步

    加去离子水定容

     

    第五步

    过滤除菌(可选步骤)

     

    注:

    1.  酶解液必须现配现用。

    2.  根据实验的需要选择酶解液是否需要过滤除菌。

    3.  培养液 CM 放在冰上预冷,便于后续使用。

    二、原生质体的分离制备

    1.  准备 7-14 d 的玉米幼苗,待幼苗的第 2 个叶片完全伸展开即可用于制备原生质体(黄化的 原生质体更稳定)。建议使用无菌播种得到的玉米幼苗,效果更佳。

    注:若使用土培苗,最好用无菌 ddH2O 冲洗擦干后使用,减少细菌的繁殖。

    2.   1-3 株玉米幼苗(样品量约 1 g,可适当增加),去除其根与叶尖。用锋利刀片垂直生长 方向,切成 0.5-1.0 mm 的小段。

    3.  将切好的小段放入装有 20 mL 酶解液50 mL 容积的小烧杯中,锡箔纸包裹,烧杯口留洞, 抽真空 30 min15 Hg/50 kpa/0.5)。

    注:避光步骤可防止原生质体重新生长出细胞壁,植物细胞壁不利于后续转化。

    4.  避光 28  , 45 rpm 摇床上孵育 4-5 h 。收集原生质体前,80 rpm 摇动 5 min ,让原生质体 完全释放出来。

    5.   1 mL 培养液 CM 润洗细胞筛后,弃废液。

    6.  将酶解后的产物用细胞筛过滤,用镊子或无菌枪头轻轻挤压酶解物帮助充分释放原生质 体,此时肉眼可见浓绿色液体滴落(挤压步骤十分重要)。用 5 mL 培养液 CM 冲洗酶解器皿和未消化的叶片 2 次(用切过尖的蓝枪头冲洗),将所有的液体收集到一个 50 mL 离心管中。

    可选:也可以在第一次过滤后,小心将植物组织转移到锥形瓶中,加入 10 mL 培养液 CM  28 ℃摇床 80 rpm摇动 5 min ,第二次过滤后,再用5 mL 培养液 CM 冲洗酶解器皿和未消 化的叶片 2 次。二次重悬过滤可以一定程度提高原生质体的产率,增加转化数。

    注:1.  操作过程尽可能轻柔,避免剧烈震荡,过滤时可以将 50 mL 离心管倾斜 70 ° , 可以缓 冲溶液下落时产生的碰撞力,防止原生质体破碎。2.  黄化苗酶解后的原生质体不呈绿色,过 滤完成后,可以取一滴酶解液镜检,如果细胞圆而发亮,则健康,可继续进行实验;如果细 胞扁且发黑,则弃去。

    7.  选用水平转子,室温 150 g 离心 10 min,升速 3 ,降速 3 ,去除上清(管中绿色沉淀即为原 生质体)。

    注:离心时,可调低离心机的升速和降速。升速过快,原生质体可能离到管壁上导致破碎; 降速过快,可能导致管底原生质体悬起。且过快的升降速会使原生质体破碎。建议升速和降 速分别都使用 3

    8.  加入 10 mL 培养液 CM 温柔重悬位于底部的原生质体(切过尖的蓝枪头),150 g 离心 8 min 升速 3 ,降速 3 ,去上清。

    9.  加入 1 mL 培养液 CM ,重悬原生质体,冰上避光静置 30 min

    10.  在离心前,可以显微镜下观察原生质体的状态和血球计数板计数。

    血球计数板的使用:

    如下图所示,在血球计数板上加上一个盖玻片,分别从两侧凹槽加入样品。使用中央区 域长和宽都是 1 mm 的方形区域进行计数(25 个中方格)。分别统计正方形四个顶角和中央 的小正方形的细胞数量,取平均值再乘以 25(正方形被分成了25 个小正方形),计算该区 域的细胞数量,该区域的体积为 0.1 µL(长 1 mm ,宽 1 mm ,高 0.1 mm )。计算获得的细胞 数量。原生质体浓度(个/mL=25 个中方格原生质体数×104 ×稀释倍数。

    11. 150 g 离心 5 min ,升速 3 ,降速 3 ,去上清,用相应体积的重悬液 RS 重悬原生质体,调 整原生质体密度为 2×105/mL 。(根据细胞数量和所需反应数,加入对应的重悬液 RS 体积, 100 μL/1 个反应)

     

    三、原生质体的转化

    1.   2 mL 的灭菌圆底离心管中加入 3-20 µg(总体积不超过 10 µL ,根据实验需要用无菌 ddH2O 补齐)纯化后的高质量质粒(建议去内毒素),随后加入 100 µL 调整好浓度的原生质 体,轻弹充分混匀。

    2.  加入 110 µL 转化液 TP ,轻弹混匀或切过尖的蓝枪头轻轻吸打混匀,过程中应避免产生 气泡,室温孵育 3-30 min(常规实验不超过 15 min)。

    注:去内毒素质粒对转化效率有极明显提升(近 3 ),建议购买 去内毒素质粒大提 试剂盒(吸附柱法)。转化液 TP 较难溶解,需 65 ℃水浴完全溶解后(约 10 min),冷却至 室温后使用。原生质体与转化液 TP 较难混匀,请耐心缓慢的吸打,以至充分混匀,保证转化效率。

    3.  加入 500 μL 培养液 CM ,轻柔颠倒混匀,终止转化。室温 150 g 离心 5 min ,升速降速 3 在不损失原生质体的情况下,尽可能去上清。

    4.  加入 500 μL 培养液 CM 重悬原生质体,室温 150 g 离心 3 min ,升速 3 ,降速 3 ,去上清。

    四、原生质体的培养和收集

    1.  加入 600 μL 孵育液 IS 培养悬浮细胞。将离心管水平室温避光放置,孵育 12-16 h

    2.  收集细胞时,缓慢拿起离心管,用枪头将附着在管壁上的细胞轻轻悬起,离心管室温垂直 静置 3 min 后再离心,室温 150 g 离心 3 min ,升速 3 ,降速 3 ,去除大部分孵育液 IS ,收集 原生质体,用于后续实验。

    注意事项:

    1.  分离制备的原生质体没有细胞壁的保护,非常脆弱,整个实验操作过程中动作尽可能轻柔。

    2.  为了避免原生质体离心时贴在管壁,建议整个实验过程使用水平转子。

    3.  实验过程中尽可能使用切过尖的 1 mL 蓝枪头,保证平滑。因为其尖端的孔径较大,会避 免原生质体破裂。

    4.  若无水平转子,可适当调整离心力、离心时间、升降速,以保证实验成功。

    5.  转化时建议添加空载荧光对照,以验证操作步骤无问题。

    6.  土培的成株期植株的组织分离效果会偏差,属于正常现象。

     

Control Render Error!ControlType:productSlideBind,StyleName:Style1,ColorName:Item0,Message:InitError, ControlType:productSlideBind Error:未将对象引用设置到对象的实例。
加入购物车