玉米原生质体制备及化学转化试剂盒(20mL/T)
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玉米原生质体制备及化学转化试剂盒(20mL/T)
货号:hyypc1141-5T 1398元
产品内容:
组份
组分名称
5T
储存温度
A 盒
酶解缓冲液 EC(Buffer EC)
80 mL
酶 E1(Enzyme 1)
1.5 g
酶 E2(Enzyme 2)
0.75 g
-20 ℃
BSA(10%)
2.5 mL
AMP(100 mg/mL)
1 mL
培养液 CM(Buffer CM)
100 mL×3
重悬液 RS(Buffer RS)
15 mL
B 盒
转化液 TP(Buffer TP) 孵育液 IS(Buffer IS)
18 mL
80 mL
RT
还原剂
100 µL
细胞筛
5 个
储存条件:A 盒,-20 ℃储存;B 盒,常温储存。
产品简介:
此试剂盒主要通过纤维素酶和离析酶消化植物细胞壁获得原生质体。适用于从 7-14 d 的玉米幼苗中分离原生质体。获得的原生质体可用于蛋白的亚细胞定位,验证蛋白间的相互作 用,转录因子的转录调控等。本试剂盒包含原生质体制备和转化需要的全部试剂,按照每次 20 mL 酶解液的使用量,可供 5次原生质体制备以及 120 个转化反应。
使用说明:
一、准备工作
1. 需要自行准备的材料:
锋利刀片;血球计数板;50 mL 离心管;2 mL 离心管,切过尖的灭菌蓝枪头和黄枪头、 10 μL白枪头(进口的更佳)。
2.酶解液配置
配制顺序 组分 20 mL 体积
第一步
酶解缓冲液 EC
酶 E1(Enzyme 1) 酶 E2(Enzyme 2)
16 mL 0.3 g 0.15 g
第二步
混匀后 55 ℃水浴 10 min ,期间颠倒混匀 2-3 次, 冷却室温后加入以下成分
第三步
BSA(10%) 还原剂
Amp(100 mg/mL)
200 µL 7. 14 µL 10 µL
第四步
加去离子水定容
第五步
过滤除菌(可选步骤)
注:
1. 酶解液必须现配现用。
2. 根据实验的需要选择酶解液是否需要过滤除菌。
3. 将培养液 CM 放在冰上预冷,便于后续使用。
二、原生质体的分离制备
1. 准备 7-14 d 的玉米幼苗,待幼苗的第 2 个叶片完全伸展开即可用于制备原生质体(黄化的 原生质体更稳定)。建议使用无菌播种得到的玉米幼苗,效果更佳。
注:若使用土培苗,最好用无菌 ddH2O 冲洗擦干后使用,减少细菌的繁殖。
2. 取 1-3 株玉米幼苗(样品量约 1 g,可适当增加),去除其根与叶尖。用锋利刀片垂直生长 方向,切成 0.5-1.0 mm 的小段。
3. 将切好的小段放入装有 20 mL 酶解液的50 mL 容积的小烧杯中,锡箔纸包裹,烧杯口留洞, 抽真空 30 min(15 Hg/50 kpa/0.5)。
注:避光步骤可防止原生质体重新生长出细胞壁,植物细胞壁不利于后续转化。
4. 避光 28 ℃ , 45 rpm 摇床上孵育 4-5 h 。收集原生质体前,80 rpm 摇动 5 min ,让原生质体 完全释放出来。
5. 用 1 mL 培养液 CM 润洗细胞筛后,弃废液。
6. 将酶解后的产物用细胞筛过滤,用镊子或无菌枪头轻轻挤压酶解物帮助充分释放原生质 体,此时肉眼可见浓绿色液体滴落(挤压步骤十分重要)。用 5 mL 的培养液 CM 冲洗酶解器皿和未消化的叶片 2 次(用切过尖的蓝枪头冲洗),将所有的液体收集到一个 50 mL 离心管中。
可选:也可以在第一次过滤后,小心将植物组织转移到锥形瓶中,加入 10 mL 的培养液 CM, 在 28 ℃摇床 80 rpm摇动 5 min ,第二次过滤后,再用5 mL 培养液 CM 冲洗酶解器皿和未消 化的叶片 2 次。二次重悬过滤可以一定程度提高原生质体的产率,增加转化数。
注:1. 操作过程尽可能轻柔,避免剧烈震荡,过滤时可以将 50 mL 离心管倾斜 70 ° , 可以缓 冲溶液下落时产生的碰撞力,防止原生质体破碎。2. 黄化苗酶解后的原生质体不呈绿色,过 滤完成后,可以取一滴酶解液镜检,如果细胞圆而发亮,则健康,可继续进行实验;如果细 胞扁且发黑,则弃去。
7. 选用水平转子,室温 150 g 离心 10 min,升速 3 ,降速 3 ,去除上清(管中绿色沉淀即为原 生质体)。
注:离心时,可调低离心机的升速和降速。升速过快,原生质体可能离到管壁上导致破碎; 降速过快,可能导致管底原生质体悬起。且过快的升降速会使原生质体破碎。建议升速和降 速分别都使用 3。
8. 加入 10 mL 培养液 CM 温柔重悬位于底部的原生质体(切过尖的蓝枪头),150 g 离心 8 min, 升速 3 ,降速 3 ,去上清。
9. 加入 1 mL 培养液 CM ,重悬原生质体,冰上避光静置 30 min。
10. 在离心前,可以显微镜下观察原生质体的状态和血球计数板计数。
血球计数板的使用:
如下图所示,在血球计数板上加上一个盖玻片,分别从两侧凹槽加入样品。使用中央区 域长和宽都是 1 mm 的方形区域进行计数(25 个中方格)。分别统计正方形四个顶角和中央 的小正方形的细胞数量,取平均值再乘以 25(正方形被分成了25 个小正方形),计算该区 域的细胞数量,该区域的体积为 0.1 µL(长 1 mm ,宽 1 mm ,高 0.1 mm )。计算获得的细胞 数量。原生质体浓度(个/mL)=25 个中方格原生质体数×104 ×稀释倍数。
11. 150 g 离心 5 min ,升速 3 ,降速 3 ,去上清,用相应体积的重悬液 RS 重悬原生质体,调 整原生质体密度为 2×105/mL 。(根据细胞数量和所需反应数,加入对应的重悬液 RS 体积, 100 μL/1 个反应)
三、原生质体的转化
1. 在 2 mL 的灭菌圆底离心管中加入 3-20 µg(总体积不超过 10 µL ,根据实验需要用无菌 ddH2O 补齐)纯化后的高质量质粒(建议去内毒素),随后加入 100 µL 调整好浓度的原生质 体,轻弹充分混匀。
2. 加入 110 µL 的转化液 TP ,轻弹混匀或切过尖的蓝枪头轻轻吸打混匀,过程中应避免产生 气泡,室温孵育 3-30 min(常规实验不超过 15 min)。
注:去内毒素质粒对转化效率有极明显提升(近 3 倍),建议购买 去内毒素质粒大提 试剂盒(吸附柱法)。转化液 TP 较难溶解,需 65 ℃水浴完全溶解后(约 10 min),冷却至 室温后使用。原生质体与转化液 TP 较难混匀,请耐心缓慢的吸打,以至充分混匀,保证转化效率。
3. 加入 500 μL 培养液 CM ,轻柔颠倒混匀,终止转化。室温 150 g 离心 5 min ,升速降速 3, 在不损失原生质体的情况下,尽可能去上清。
4. 加入 500 μL 培养液 CM 重悬原生质体,室温 150 g 离心 3 min ,升速 3 ,降速 3 ,去上清。
四、原生质体的培养和收集
1. 加入 600 μL 孵育液 IS 培养悬浮细胞。将离心管水平室温避光放置,孵育 12-16 h。
2. 收集细胞时,缓慢拿起离心管,用枪头将附着在管壁上的细胞轻轻悬起,离心管室温垂直 静置 3 min 后再离心,室温 150 g 离心 3 min ,升速 3 ,降速 3 ,去除大部分孵育液 IS ,收集 原生质体,用于后续实验。
注意事项:
1. 分离制备的原生质体没有细胞壁的保护,非常脆弱,整个实验操作过程中动作尽可能轻柔。
2. 为了避免原生质体离心时贴在管壁,建议整个实验过程使用水平转子。
3. 实验过程中尽可能使用切过尖的 1 mL 蓝枪头,保证平滑。因为其尖端的孔径较大,会避 免原生质体破裂。
4. 若无水平转子,可适当调整离心力、离心时间、升降速,以保证实验成功。
5. 转化时建议添加空载荧光对照,以验证操作步骤无问题。
6. 土培的成株期植株的组织分离效果会偏差,属于正常现象。