苹果愈伤组织原生质体制备试剂盒

苹果愈伤组织原生质体制备试剂盒

货号：hyypc1191-5T     1398元

产品内容：

运输及储存条件：本试剂为干冰运输；A 盒试剂避光保存于-20℃; B 盒常温保存；有效期 18 个月。

产品介绍：

试剂盒主要通过酶的消化作用，酶解植物细胞壁获得原生质体。适用于从苹果愈伤组织中分离原生质体。 获得的原生质体可用于蛋白的亚细胞定位，验证蛋白间的相互作用，转录因子的转录调控等。

产品特点：

本试剂盒包含原生质体制备和转化需要的全部试剂，按照每次 20 mL 酶解液的使用量，可供 5 次原生质体 制备以及 120 个转化反应。

注意事项：

1.  分离制备的原生质体没有细胞壁的保护，非常脆弱，整个实验操作过程中动作尽可能轻柔。

2.  为了避免原生质体离心时贴在管壁，建议整个实验过程使用水平转子。

3.  实验过程中尽可能使用切过尖的 1 mL 蓝枪头，保证平滑，可减少原生质体破裂。

4.  若无水平转子，可适当调整离心力、离心时间、升降速，以保证实验成功。

5.  转化时建议添加空载荧光对照， 以验证操作步骤无问题。

操作步骤：（在开始操作前请先阅读注意事项）

一、准备工作

1. 需要自行准备的材料

锋利刀片；血球计数板；50 mL 离心管；2 mL 离心管，切过尖的灭菌蓝枪头和黄枪头、10 µL白枪头（进口的更佳）。

2.酶解液配制

注：

1.  酶解液必须现配现用。

2.  根据实验的需要选择酶解液是否需要过滤除菌。

3.  将培养液 CM 放在冰上预冷，便于后续使用。

二、原生质体的分离制备

1.  准备苹果愈伤组织，取材以继代 15 d 后黄色疏松的愈伤组织为优。

2.  在超净工作台中进行操作，取 1 g 苹果愈伤组织。用锋利刀片将愈伤切成直径为 1.0 mm 的组织。

3.  将切好的组织放入装有 20 mL 酶解液的 50 mL 容积的小烧杯中，锡箔纸包裹，烧杯口留洞，抽真空 15 min （15 Hg/50 kpa/0.5）。

注：避光步骤可防止原生质体重新生长出细胞壁，植物细胞壁不利于后续转化。

4.  避光 28 ℃ , 45 rpm/min 摇床上孵育 6 h 。收集原生质体前，80 rpm ， 5 min ，让原生质体充分释放。

5.  用 1 mL 培养液 CM 润洗细胞筛后，弃废液。

6.  将酶解后的产物用细胞筛过滤，用镊子或无菌枪头轻轻挤压酶解物帮助充分释放原生质体，此时肉眼可 见浓绿色液体滴落（挤压步骤十分重要）。用 5 mL 的培养液 CM 冲洗酶解器皿和未消化的叶片 2 次（用

切过尖的蓝枪头冲洗），将所有的液体收集到一个 50 mL 离心管中。

可选：也可以在第一次过滤后，小心将植物组织转移到锥形瓶中，加入 10 mL 的培养液 CM ，在 28 ℃摇 床 80 rpm摇动 5 min ，第二次过滤后，再用 5 mL 培养液 CM 冲洗酶解器皿和未消化的叶片2 次。二次重 悬过滤可以一定程度提高原生质体的产率，增加转化数。

注：操作过程尽可能轻柔，避免剧烈震荡，过滤时可以将 50 mL 离心管倾斜 70 ° , 可以缓冲溶液下落时产 生的碰撞力，防止原生质体破碎。

7.  用切过尖的蓝枪头，取一滴酶解液进行镜检。若在 100×视野中可观察到圆形的原生质体，则可继续进 行实验。若视野内原生质体大量破碎或皱缩发黑，则弃去。

8.  选用水平转子，室温 100 g 离心 3 min ，升速 3 ，降速 3 ，去除上清（管中绿色沉淀即为原生质体）。

注：离心时，可调低离心机的升速和降速。升速过快，原生质体可能离到管壁上导致破碎；降速过快，可 能导致管底原生质体悬起。且过快的升降速会使原生质体破碎。建议升速和降速分别都使用 3。

9.  加入 10 mL 培养液 CM 温柔重悬位于底部的原生质体（切过尖的蓝枪头），100 g 离心 2 min ，升速 3， 降速 3 ，去上清。

10.  加入 1 mL 培养液 CM ，重悬原生质体，冰上避光静置 30 min。

11.  在离心前，可以显微镜下观察原生质体的状态和血球计数板计数。

血球计数板的使用：

如下图所示，在血球计数板上加上一个盖玻片，分别从两侧凹槽加入样品。使用中央区域长和宽都是 1 mm  的方形区域进行计数（25 个中方格）。分别统计正方形四个顶角和中央的小正方形的细胞数量，取平均值 再乘以 25（正方形被分成了25 个小正方形），计算该区域的细胞数量，该区域的体积为 0. 1 µL（长 1 mm， 宽 1 mm ，高 0. 1 mm ）。计算获得的细胞数量，原生质体浓度（个/mL）=25 个中方格原生质体数×104× 稀释倍数。

12.  100 g 离心 2 min ，升速 3 ，降速 3 ，去上清，用相应体积的重悬液 RS 重悬原生质体，调整原生质体密度为2×105/mL 。（根据细胞数量和所需反应数，加入对应的重悬液 RS 体积，100 µL/1 个反应）

三、原生质体的转化

1.  在 2 mL 的灭菌圆底离心管中加入 3-20 µg（总体积不超过 10 µL ，根据实验需要用无菌 ddH2O 补平） 纯化后的高质量质粒（建议去内毒素），随后加入 100 µL 调整好浓度的原生质体，轻弹充分混匀。

2.  加入 110 µL 的转化液 TP ，轻弹混匀或切过尖的蓝枪头轻轻吸打混匀，过程中应避免产生气泡，室温孵 育 3-30 min（常规实验不超过 15 min）。

注：去内毒素质粒对转化效率有极明显提升（近 3 倍） ，建议购买去内毒素质粒大提试剂盒（吸 附柱法）。转化液 TP 较难溶解，需 65 ℃水浴完全溶解后（约 10 min），冷却至室温后使用。原生质体与 转化液 TP 较难混匀，请耐心缓慢的吸打， 以至充分混匀，保证转化效率。

3.  加入 500 µL 培养液 CM ，轻柔颠倒混匀，终止转化。室温 150 g 离心 3 min ，升速降速 3 ，在不损失原 生质体的情况下，尽可能去上清。

4.  加入 500 µL 培养液 CM 重悬原生质体，室温 150 g 离心 3 min ，升速 3 ，降速 3 ，去上清。

四、原生质体的培养和收集

1.  加入 500 µL 培养液 CM 培养悬浮细胞。将离心管水平室温避光放置，孵育 12-16 h。

2.  收集细胞时，缓慢拿起离心管，用枪头将附着在管壁上的细胞轻轻悬起，离心管室温垂直静置 3 min 后 再离心，室温 150 g 离心 3 min ，升速 3 ，降速 3 ，去除大部分培养液 CM ，收集原生质体，用于后续实验。