番茄原生质体制备及转化试剂盒（20 mL/T）

番茄原生质体制备及转化试剂盒（20 mL/T）

货号：hyypc1171-5T     1398元

产品内容：

运输及储存条件：A 盒为蓝冰运输，B 盒为常温运输；收货后应将 A 盒避光保存于-20℃，

B 盒保存于 2-8℃；本试剂盒溶液易污染，建议开封后立即使用；试剂盒组分未开封的有效期为 18 个月。

产品介绍：

本试剂盒主要通过酶的消化作用，酶解植物细胞壁获得原生质体。适用于从番茄幼嫩叶片中分离和转化原生质体。获得的原生质体可用于蛋白的亚细胞定位，验证蛋白间的相互作用，转录因子的转录调控等实验。

产品特点：

本试剂盒包含原生质体制备和转化需要的全部试剂，按照每次 20 mL 酶解液的使用量，可供5 次原生质体制备以及 120 个转化反应。

注意事项：

1. 分离制备的原生质体没有细胞壁的保护，非常脆弱，整个实验操作过程中动作尽可能轻柔。

2. 为了避免原生质体离心时贴在管壁，建议整个实验过程使用水平转子。

3. 实验过程中尽可能使用切过尖的 1 mL 蓝枪头，保证切口平滑，可减少原生质体破裂。

4. 转化时建议添加空载荧光对照（例如 pBI221-EGFP），以验证操作步骤无问题。

5. 本试剂盒经过多次质检，可确保实验的稳定性。若实验员为首次实验，建议进行预实验以熟练操作流程。

6. 请使用去内毒素质粒进行转化。

操作步骤：（在开始操作前请先阅读注意事项）

一、准备工作

1. 需要自行准备的材料

锋利刀片；血球计数板；50 mL 圆底离心管；2 mL 离心管，切过尖的灭菌蓝枪头和黄枪头、10 µL 白枪头。

2.酶解液配制

注：

1. 酶解液必须现配现用。

2. 根据实验的需要选择酶解液是否需要过滤除菌。

3. 若近 30 d 内频繁实验，可将酶解缓冲液 EC1 和 EC2 至于 4℃保存。

二、原生质体的分离制备 

1. 准备番茄土培材料或组培瓶苗，取材以 20 d 后的幼嫩真叶为优。

2. 取 5-10 片（约 1 g）叶片，用锋利刀片平行主叶脉，切成 0.5-1.0 mm 的细条。

3. 将切好的细条放入装有 20 mL 酶解液的 50 mL 容积的小烧杯中，锡箔纸包裹。烧杯口留洞，抽真空 30 min（15 Hg/50 kpa/0.5 kg/cm2）。

注：避光步骤可防止原生质体的光合作用，有氧呼吸释放的活性氧可能不利于原生质体生存。

4. 避光 28℃，45 rpm/min 摇床上孵育 4 h。

5. 用 1 mL 培养液 CM 润洗细胞筛后，弃废液。

6. 将酶解后的产物用细胞筛过滤，用镊子或无菌枪头尾部轻轻挤压酶解物帮助其充分释放原生质体，此时肉眼可见浓绿色液体滴落（挤压步骤十分重要）。用 5 mL 的培养液 CM 冲洗 酶解器皿和未消化的叶片 2 次（用切过尖的蓝枪头冲洗），将所有的液体收集到一个 50 mL圆底离心管中。

可选：也可以在第一次过滤后，小心将植物组织转移到锥形瓶中，加入 10 mL 的培养液 CM， 在 28 ℃摇床 80 rpm 摇动 5 min，第二次过滤后，再用 5 mL 培养液 CM 冲洗酶解器皿和未消化的叶片 2 次。二次重悬过滤可以一定程度提高原生质体的产率，增加转化数。

注：操作过程尽可能轻柔，避免剧烈震荡，过滤时可以将 50 mL 离心管倾斜 70°，可以缓冲溶液下落时产生的碰撞力，防止原生质体破碎。

7. 用切过尖的蓝枪头，取一滴酶解液进行镜检。若在 100×视野中可观察到圆形的原生质体，则可继续进行实验。若视野内原生质体大量破碎或皱缩发黑，则弃去。

8. 选用水平转子，室温 150 g 离心 3 min，升速 3，降速 3，去除上清（管中绿色沉淀即为原生质体）。去除上清时尽量避免损失沉淀，必要时可留取部分液体。

注：离心时，可调低离心机的升速和降速。升速过快，原生质体可能离到管壁上导致破碎；降速过快，可能导致管底原生质体悬起。且过快的升降速会使原生质体破碎。建议升速和降速分别都使用 3。

9. 加入 10 mL 培养液 CM，室温 150 g 离心 3 min，升速 3，降速 3，去除上清。

10. 加入 1 mL 培养液 CM，重悬原生质体，用切过尖的蓝枪头将其转移至 2 mL 圆底离心管内，冰上避光静置 15 min。

注：在离心前，可以显微镜下观察原生质体的状态和血球计数板计数。

150 g 离心 3 min，升速 3，降速 3，去上清，用相应体积的重悬液 RS 重悬原生质体（约1-2 mL），调整原生质体密度为 2×105 /mL（根据细胞数量和所需反应数，加入对应的重悬液 RS 体积，100 µL/1 个反应）。

血球计数板的使用：

如下图所示，在血球计数板上盖玻片，分别从两侧凹槽加入样品。使用中央区域长和宽都是1 mm 的方形区域进行计数（25 个中方格）。分别统计正方形四个顶角和中央的小正方形的细胞数量，取平均值再乘以 25（正方形被分成了 25 个小正方形），计算该区域的细胞数量，该区域的体积为 0.1 µL（长 1 mm，宽 1 mm，高 0.1 mm）。计算获得的细胞数量，原生质体浓度（个/mL）=25 个中方格原生质体数×10⁴×稀释倍数。

 三、原生质体的转化

1. 在 2 mL 的灭菌圆底离心管中加入 3-20 µg（总体积不超过 10 µL，根据实验需要用无菌ddH2O 补齐）纯化后的高质量质粒（建议去内毒素），随后加入 100 µL 调整好浓度的原生质体，轻弹充分混匀。

2. 向上述溶液加入 110 µL 的转化液 TP，轻弹混匀或切过尖的蓝枪头轻轻吸打混匀，过程中应避免产生气泡，室温避光孵育 15 min。请注意严格控制孵育时间，不要因需要操作过多的实验组，导致孵育超时，致使转化失败。

注：去内毒素质粒对转化效率有极明显提升（近 3 倍），建议购买去内毒素质粒大提试剂盒（增强型）。转化液 TP 若有沉淀析出，可 55 ℃水浴完全溶解后（约 5 min），冷却至室温后使用。原生质体与转化液 TP 较难混匀，请耐心缓慢的吸打，以至充分混匀，保证转化效率。

3. 加入 0.5 mL 培养液 CM，轻柔颠倒混匀，终止转化。室温 150 g 离心 3 min，升速降速 3，在不损失原生质体的情况下，尽可能去上清。

4. 加入 0.5 mL 培养液 CM 重悬原生质体，室温 150 g 离心 3 min，升速降速 3，去上清。

四、原生质体的培养和收集

1. 加入 1 mL 培养液 CM 培养悬浮细胞，此时可取样镜检，观察原生质体状态。随后将离心管水平室温避光放置，孵育 12-16 h。

2. 收集细胞时，缓慢拿起离心管，用枪头将附着在管壁上的细胞轻轻悬起，离心管室温垂直静置 3 min 后再离心，室温 150 g 离心 3 min，升速 3，降速 3，去除大部分培养液 CM，收集原生质体，用于后续实验。

可选：用 1 mL 10%BSA 润洗细胞培养板后，将 1 mL 培养液 CM 加入细胞培养板备用。将 1mL 培养液 CM 重悬原生质体，将其加入上述细胞培养板中，室温过夜培养。相较于离心管，更适合原生质体孵育。