BL21-Gold(DE3)pRARE2感受态细胞
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BL21-Gold(DE3)pRARE2感受态细胞
BL21-Gold(DE3)pRARE2 Chemically Competent Cell
cat：hyyWB03-1ml 10*100ul
BL21-Gold(DE3)pRARE2感受态细胞
基因型
E. coli B F- ompT hsdS(rB- mB- ) dcm+ Tet r gal λ(DE3) endA Hte pRARE2 (CamR)
BL21-Gold(DE3)pRARE2感受态细胞
产品说明
BL21-Gold(DE3)pRARE2菌株来源于Stratagene公司的BL21菌株，缺少Lon蛋白酶和OmpT蛋白酶，减少对重组蛋白的降解。BL21-Gold(DE3)pRARE2菌株的染色体中整合了一个有功能的Dcm甲基化酶，可以促进质粒的稳定，防止被自身的限制酶系统降解；引入了Hte基因，可以提高转化效率； 缺失核酸内切酶 (endA)，提高了质粒DNA的产量、质量和稳定性。另外该菌株与BL21(DE3)一样，染色体中也整合了λ噬菌体DE3区 (DE3区含有T7噬菌体RNA聚合酶)，可同时表达T7 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶，pRARE2质粒可补充大肠杆菌缺乏的7种稀有密码子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA和CGG)对应的tRNA，提高外源基因的表达水平可用于pET系列、pGEX、pMAL等质粒的蛋白表达，同时具有四环素、氯霉素抗性。
BL21-Gold(DE3)pRARE2感受态细胞
操作方法
1. BL21-Gold(DE3)pRARE2感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的质粒，并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。
2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。
3. 向离心管中加入700 μl不含抗生素的无菌培养基 (2YT或LB)，混匀后37℃，200 rpm复苏60分钟。
4. 5000 rpm离心一分钟收菌，留取50 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。
5. 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。
BL21-Gold(DE3)pRARE2感受态细胞
蛋白小量诱导表达Protocol (for reference only)
1. 小摇接菌：在透气试管或透气离心管中准备1-3ml 含相应抗生素的液体LB（或2YT、TB、SB等营养丰富培养基），接入一个含有目的质粒的新鲜单菌落。
2. 37℃，200 rpm过夜摇菌约10-15h。
3. 大摇接菌：将第一步的小摇菌液按1-2%比例接菌到50ml 含相应抗生素的LB（或2YT、TB、SB等营养丰富培养基），为增加溶氧，最好使用500ml 三角瓶（加入营养液的体积一般为三角瓶标定体积的1/10，最高不超过1/5）。
4. 37℃，150 rpm摇菌到OD600值为0.5-0.8（一般需要2-4h）。
5. 空白对照取样（可选步骤）：在加入诱导剂IPTG前可取样1ml菌液到1.5ml 离心管中，12000rpm离心1分钟，弃上清，沉淀放-20℃保存待用。
6. 蛋白的诱导表达：
1）若选择37度诱导蛋白，直接在第四步的三角瓶中加入IPTG至终浓度为1mM（IPTG浓度可自由调整），继续37℃，120 rpm摇菌2-4h。
2）若选择低温诱导，可将第四步的三角瓶放入冰水中1-5min，待菌液温度接近所选温度时，拿出三角瓶，加入IPTG至终浓度为1mM（IPTG浓度可自由调整），继续120 rpm摇菌培养（一般25度需培养10-16h，16度需培养16-24h，12度需培养20-36h；最佳诱导时间，温度，IPTG浓度需实验者优化）。
7. 不同时间点取样（可选步骤）：最佳摇菌时间与所表达蛋白有关，表达蛋白不同最佳摇菌时间不同，为找到最佳诱导时间可在不同诱导时间点取样（例：在诱导第2h，4h，6h，8h，14h取样，离心后放-20℃保存）。
8. 离心收菌：三角瓶从摇床拿出，埋入冰中10 分钟， 4℃，5000g，10分钟离心，弃上清，沉淀保存在-20℃。
9. 待所有样品准备妥当，可以做SDS-PAGE分析蛋白表达。
BL21-Gold(DE3)pRARE2感受态细胞
1 M IPTG溶液配制：2.38 g IPTG加入无菌的双蒸水10 mL，完全溶解后用0.22um的滤膜过滤除菌。
BL21-Gold(DE3)pRARE2感受态细胞
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化，插入冰中8分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率，混入质粒时应轻柔操作，转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
2. BL21-Gold(DE3)pRARE2菌株携带pRARE2质粒，除复苏培养基无抗生素外，其余所用培养基、培养液均应含有34 µg/ml氯霉素，以防质粒丢失。
3. BL21-Gold(DE3)pRARE2菌株具有四环素、氯霉素抗性，不可用于具有四环素、氯霉素抗性质粒的转化。
4. 为获得需要量的蛋白，最佳诱导时间，温度，IPTG浓度需实验者优化。
