TOP10(araBADC–)感受态细胞
-
TOP10(araBADC–)感受态细胞
TOP10(araBADC–) Chemically Competent Cell
产品规格 （CATHYYWB04）10*100UL
TOP10(araBADC–)： 100μl/支
TOP10(araBADC–)感受态细胞基因型：
F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80 lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 araΔ139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG
TOP10(araBADC–)感受态细胞产品说明：
TOP10(araBADC–)为原核表达专用菌株，此菌株的阿拉伯糖操纵子被破坏，可用于阿拉伯糖诱导的原核表达，多用于pBAD/His A, B, and C ，pBAD/Myc-His A, B, and C等质粒的原核表达。recA1和endA1的突变有利于插入DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。可用于构建质粒、扩繁质粒、蓝白斑筛选、原核蛋白表达等实验。
TOP10(araBADC–)感受态细胞操作方法：
1. TOP10(araBADC–)感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA（质粒或连接产物）并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。
2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。
3. 向离心管中加入700 μl不含抗生素的无菌培养基 (2YT或LB)，混匀后37℃，200 rpm复苏60分钟。
4. 5000 rpm离心1分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。
5. 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。如果进行蓝白斑筛选操作，将平板放37℃培养至少13 h。
TOP10(araBADC–)感受态细胞：
蛋白小量诱导表达Protocol (for reference only)
1. 小摇接菌：在透气试管或透气离心管中准备1-3ml 含相应抗生素的液体LB（或2YT、SOB、TB（唯地CAT#：CM1018L）等营养丰富培养基），接入一个含有目的质粒的新鲜单菌落。以质粒pBAD/HisA为例：在TB营养液中过夜培养的菌体浓度约为LB的3-5倍，SOB的2-3倍。
2. 37℃，200 rpm过夜摇菌约10-15h。
3. 大摇接菌：将第一步的小摇菌液按1-2%比例接菌到50ml 含相应抗生素的LB（或2YT、SOB、TB等营养丰富培养基），为增加溶氧，最好使用500ml 三角瓶（加入营养液的体积一般为三角瓶标定体积的1/10，最高不超过1/5）。
4. 37℃，150-200 rpm摇菌到OD600值为0.5-0.6（一般需要2-3h）。
5. 空白对照取样（可选步骤）：在加入诱导剂前可取样1ml菌液到1.5ml 离心管中，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀放-20℃保存待用。
6. 第四步的三角瓶中加入L-阿拉伯糖至终浓度为2%、0.2%、0.02%、0.002%（L-阿拉伯糖浓度可自由调整，可以10倍为稀释梯度，做梯度试验），继续37℃，150-200 rpm摇菌4h。
7. 不同时间点取样（可选步骤）：最佳摇菌时间与所表达蛋白有关，表达蛋白不同最佳摇菌时间不同，为找到最佳诱导时间可在不同诱导时间点取样（例：在诱导第2h，3h，4h，5h取样，离心后放-20℃保存）。
8. 离心收菌：三角瓶从摇床拿出，埋入冰中10 分钟， 4℃，5000g，10分钟离心，弃上清，沉淀保存在-20℃。
9. 待所有样品准备妥当，可以做SDS-PAGE分析蛋白表达。
TOP10(araBADC–)感受态细胞注意事项：
1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化，插入冰中8分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率。
2. 混入质粒时应轻柔操作，转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 诱导时，L-阿拉伯糖浓度可自由调整，可以10倍为稀释梯度，做梯度试验。为获得需要量的蛋白，最佳诱导时间，温度，诱导剂浓度需实验者优化。
4. TOP10(araBADC–)也可用于扩繁质粒，若要获得大量，高纯度质粒，建议在TB培养基（唯地CAT#：CM1018L）中摇菌培养（以标准质粒PUC19为例：在TB营养液中过夜培养的菌体浓度和质粒产量为LB的3-4倍，SOC的2倍）
