纤维素（CLL）含量检测试剂盒
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纤维素（CLL）含量检测试剂盒
可见分光光度法
规格: 50T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系华越洋工作人员。
试剂名称
规格
保存条件
提取液一
液体 200 mL×1 瓶（自备）
4℃保存
提取液二
液体 60 mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
粉剂×1 瓶
4℃保存
试剂二
液体 10 mL×1 瓶
4℃保存
标准品
粉剂×1 支
4℃保存
溶液的配制：
1、 提取液一：80%乙醇 200 mL，即将 160 mL 无水乙醇和 40 mL 蒸馏水混合，自备。提供一个 125 mL 空瓶。
2、 标准品：10 mg 葡萄糖。临用前加入 1 mL 蒸馏水溶解，配成 10 mg/mL 葡萄糖溶液备用，2-8℃保存两周。
3、 工作液的配制：在试剂一中加入 2.5 mL 试剂二，充分混匀，如较难溶解，可充分震荡或加热搅拌；用不完的试剂，4℃可保存一周。
产品说明：
纤维素是由β-D-葡萄糖单元以 β-1,4-糖苷键连接而成的直链多聚体，通常与半纤维素、果胶及木质素结合在一起，是植物细胞壁的主要结构成分。以纤维素为原料的产品广泛应用于食品、造纸、塑料、炸药、电工及科研器材等领域。
纤维素在酸性条件下加热能分解成β-D-葡萄糖。在强酸作用条件下利用与蒽酮显色剂测定纤维素含量。
纤维素（CLL）含量检测试剂盒
技术指标：
最低检出限：0.0023 mg/mL
线性范围：0.003125-0.09 mg/mL
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、台式低温离心机、水浴锅、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰盒、丙酮、浓硫酸、无水乙醇、蒸馏水和EP管。
纤维素（CLL）含量检测试剂盒
操作步骤： 一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
- 细胞壁物质（CWM）的提取：
- 称取约 0.3g（记为 W1）样本，加入 1mL 提取液一，室温快速匀浆，90℃水浴 20min，冷却至室温，6000g，25℃ 离心 10min，弃上清。
- 沉淀先后用 1.5mL 提取液一和丙酮各洗两遍（涡旋振荡 2min 左右，6000g，25℃离心 10min，弃上清即可）， 沉淀即为粗细胞壁。
- 在粗细胞壁中加入 1mL 提取液二（去除淀粉）浸泡 15 小时，6000g，25℃离心 10min，弃上清，将沉淀 用蒸馏水清洗两遍（涡旋振荡 2min 左右，6000g，25℃离心 10min，弃上清即可），之后干燥沉淀（60-100℃ 均可），得到细胞壁物质（CWM），称重记为 W2。
- 纤维素的提取：
- 称取烘干的 CWM 约 5mg（记为 W3），加入 0.5mL 蒸馏水充分匀浆，匀浆液转移至 EP 管中，用蒸馏水 定容至 0.5mL。
- 将定容后的匀浆液置于冰水混合物中，缓慢加入 0.75mL 浓硫酸，缓慢混匀，冰水浴中静置 30min。8000g， 4℃离心 10min，取上清液，用蒸馏水稀释 20 倍后待测。
纤维素（CLL）含量检测试剂盒
注意：
- 若样本或者干燥后的沉淀质地坚硬，可以先研碎再进行后续步骤
2. 在提取纤维素的过程中，首先，置于冰水浴中的 EP 管需要固定，不要上下左右浮动，一方面保障自身 安全，另一方面防止冰水混合物进入 EP 管造成试验误差；再者，加入浓硫酸时，建议枪头伸入样本液面以下， 缓慢加入，防止液面沸腾及样本碳化。
二、测定步骤 1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至620nm，蒸馏水调零。 2、 将10mg/mL标准液用蒸馏水稀释为0.09、0.08、0.07、0.05、0.025、0.0125、0.00625mg/mL的标准溶液备用。 3、 标准品稀释表
实验中每个标准管需300µL标准溶液。
4、 操作表 (在1.5mL离心管中) ：
试剂名称（µL）
测定管
标准管
空白管
样本
300
-
-
标准溶液
-
300
-
蒸馏水
-
-
300
工作液
70
70
70
浓硫酸
630
630
630
混匀，置 95℃水浴 10min（盖紧，防止水分散失），取出后冷却至室温，测定 620nm 处吸光值 A， 分别记为A 测定管，A 标准管，A 空白管。计算 ΔA=A 测定管-A 空白管，ΔA 标准=A 标准管-A 空白管。（空白管及标准曲线均只需检测 1-2 次）
- 纤维素含量计算
- 标准曲线的绘制：
根据标准管的浓度（x，mg/mL）和吸光度ΔA标准（y，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA（y，ΔA） 带入公式计算样本浓度（x，mg/mL）
- 纤维素含量的计算：
- 按样本质量计算 纤维素（mg/g 质量）=x×V提取×20×（W2÷W3）÷W1÷1.11=22.52×x×W2÷W3÷W1
- 按样本细胞壁物质（CWM）质量计算 纤维素（mg/g干重）=x×V提取×20÷W3÷1.11=22.52x÷W3
1.11：是此法测得葡萄糖含量换算为纤维素含量的常数，即111 µg葡萄糖用蒽酮试剂显色相当于100µg纤维素 蒽酮试剂所显示的颜色；V提取：纤维素提取液体积，1.25mL（0.5mL蒸馏水+0.75mL浓硫酸）；20：样本稀释倍 数；W1：样本质量，0.3g；W2：样本细胞壁物质（CWM）质量，g；W3，提取纤维素时称取的细胞壁物质（CWM） 质量，g。
注意事项：
- 如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。
- 浓硫酸具有强腐蚀性，操作时各个步骤均需特别注意：纤维素提取在加入浓硫酸时，建议枪头伸入样本液面 以下，缓慢加入，以防止液体飞溅烧伤；95℃水浴结束取出后需冷却至室温再打开EP管盖，以防液体飞溅烧伤。
- 由于试剂二挥发性强且具有刺激性气味，建议在通风橱中进行工作液的配制。
实验实例：
取0.3g康乃馨叶片样本提取细胞壁物质（CWM）0.02g，称取烘干的CWM约 5mg（记为W3），提取纤维素， 取上清液，用蒸馏水稀释20倍后进行检测，测得计算ΔA=A测定管-A空白管=0.821-0.051=0.77，标准曲线 y=13.994+0.0072，计算x=0.0545，按样本质量计算得： 纤维素（mg/g 质量）=22.52×x×W2÷W3÷W1=16.3645 mg/g 质量。
