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Y187-pHis2 系统酵母单杂互作验证试剂盒

Y187-pHis2 系统酵母单杂互作验证试剂盒
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    Y187-pHis2 系统酵母单杂互作验证试剂盒

    cat:huayueyuang7732

     

     

    产品组成:

    产品

    产品名称

    规格

     

    分一

    常温储

     

     

    养基

    SD/-Trp with Agar  (备用)

    0.5L

    SD/-Leu/-Trp with Agar

    0.5L×4

    SD/-His/-Leu/-Trp with Agar

    0.5L×3

     

     

    成分

    -20℃

    选剂

    3-AT  (2.5M,过滤除菌)

    5×5mL

    鉴定试剂盒

    酵母阳性克隆快速检测试剂盒

    20T

     

    质粒

    pGADT7-Rec2 质粒

    10μg

    pHis2 质粒

    10μg

     

     

    成分

    -80℃

     

     

    对照菌株

    Y187[p53-His2]  (备用)

    0.2mL

    Y187[p53-His2+pGADT7-p53]

    0.2mL

    Y187[p53-His2+pGADT7]

    0.2mL

    感受态细胞

    Y187 感受态细胞

    20×100μL/

    注:

    1.  本试剂盒可用于 10 对单杂互作验证 (质粒除外)。

    2.  注意每个成份的保存温度, 感受态细胞务必-80℃保存。

    3. 0.5L×2 表示: 2 个包装, 每个包装 0.5L;5×1mL 表示: 1 个包装,含 5 个 1mL。

    4.  对照菌株的最佳 3-AT 浓度参考网站菌株说明书。

    5.  本方案不适用大批量酵母单杂交实验,因为诱饵自激活检测和毒性验证应该预先完成。

     

    产品说明:

    Y187 菌株是 GAL4 系统酵母单双杂实验常用菌株,MATα 型,可直接转化质粒或与 MATa 型酵母菌 株(Y2HGold,AH109 等) 通过 mating 操作进行筛库实验。 筛选标志为:trp1,leu2,报告基因为:lacZ , MEL1 。Y187-pHis2 系统酵母单杂需要 pHis2 和 pGADT7-Rec 两种质粒配套使用。质粒 pHis2 的筛选标志 为 TRP,用于表达 pBait-His2 construct (1~3 个 bait DNA 序列重复串联后克隆到 pHis2 中);质粒 pGADT7的筛选标志为 LEU,用于表达 AD(GAL4 C 端 768~881 位氨基酸)与目标蛋白(Prey)的融合蛋白。Y187-pHis2系统酵母单

     

    杂原理:当猎物蛋白(Prey) 结合到诱饵序列(Bait DNA) 上,GAL4 AD 就会激活

    下游报告基 HIS3 的表达,能够在含有 3-AT 的培养基上生长,从而确定 DNA 和蛋白有相互。

    本方案中检测诱饵酵母菌株的 3-AT 最佳使用浓度和互作验证都采用了稀释点板的方法,与涂板的方 法相比, 点板法能更直观的体现出 DNA 和蛋白的互作, 还能减少培养基和 3-AT 的使用量。本方案还对常 见的酵母单杂结果进行了分析。

    目录

    一、实验耗材和试剂--------- -----------2

    二、菌株使用与保存---------------------3

    三、实验方法---------------------------3

    3.1 Bait 和 Prey 共转化 Y187-----------3

    3.2  阳性克隆鉴定----------------------4

    3.3 互作验证---------------------------4

    互作验证分析------------------------5

    4.1 互作-------------------------------5

    4.2 Prey 蛋白有毒性--------------------5

    4.3 无互作-----------------------------5

    4.4 Bait 有自激活----------------------6

    五、注意事项---------------------------7

     

    一、实验耗材和试剂

    本试剂盒提供的产品以产品组成为准,部分试剂和耗材需要自备,也可以在本公司单独购买。

    1.  灭菌的枪头 (1000 μL、200 μL、10 μL)、涂布棒或玻璃珠,Φ90 mm 培养皿,备用。

    2. Carrier DNA 在 95- 100 ℃水浴 5 min,后快速冰浴,可再重复一次,备用。

    4.  自备 0.9%生理盐水,可用 ddH2O 无菌水代替,备用。

    5.  普通平板制备

    1 条培养基溶于 0.5 L 去离子水中,无需调节 pH 值,高压灭菌(如,115 ℃灭菌 20 min)。液体培养基 4 ℃ 冰箱保存; 固体培养基, 20-25 mL/块倒平板(Φ90 mm),凝固后 4 ℃冰箱保存。

    6.  特殊平板制备

    SD/-His/-Leu/-Trp with Agar  (3-AT):将一条 SD/-His/-Leu/-Trp with Agar 培养基溶于 500 mL 去离子水, 无 需调节 pH 值,高压灭菌(如,115 ℃灭菌 20 min),冷却至 50 ℃左右,每 25 mL 固体培养基,按照表 1 加入 3-AT,混匀倒平板 25 mL/块 (Φ90 mm),凝固后于 4 ℃冰箱保存。

     

     1  不同浓度 3-AT 平板

     

    养基体积 (mL)

    25

    25

    25

    25

    25

    25

    3-AT  (2.5 M)加入量 (μL)

    50

    100

    300

    500

    800

    1000

    3-AT  (mM)

    5

    10

    30

    50

    80

    100

     

    二、菌株使用与保存

    1.  挑取甘油保存的对照菌液 (10-50 μL)于 SD 平板上划线, 28-30 ℃培养 3-5 d,培养出来的单菌落可直 接用于互作验证实验。

    2.  挑取上述单菌落于 SD 液体培养基中, 200 r/min、28-30 ℃振荡培养 2 d,OD600 应大于 1,取 1 mL 菌液 集菌,弃上清,加入 0.2 mL 15%甘油, -80 ℃可长期保存。

    注: Y187[p53-His2+pGADT7-p53]和 Y187[p53-His2+pGADT7]用 SD/-Leu/-Trp 培养基, Y187[p53-His2]用 SD/-Trp 培养基。

     

    三、实验方法

    Y187-pHis2 系统酵母单杂互作验证实验方案较多,本公司根据多年经验,给出一个较优方案, 首先我 们将自激活检测和毒性验证放在互作检测之后 (本方案不作分析)。略过载体构建,分为三个步骤: Bait    Prey 共转化 Y187 ,阳性克隆鉴定,互作验证。 此外,本方案还对常见的互作验证结果进行了分析。

     

    3.1 Bait 和 Prey 共转化 Y187

    AD-Prey、AD- Empty、pBait-His2 、p53-His2 和 Empty pHis2 空载(或 Mutant Bait pHis2)测序后,将大肠杆菌菌液进行扩大培养, 然后提取质粒。

    1.  取 100 µL 冰上融化的 Y187 感受态细胞(货号:CC306),依次加入预冷的质粒 Bait 和 Prey(各 1-2 µg), Carrier DNA 10 µL  (95- 100 ℃ ,5 min,快速冰浴,重复一次),PEG/LiAc 500 µL 并吸打几次混匀, 30 ℃ 水浴 30 min (15 min 时翻转 6-8 次混匀)。

    2.  将管放 42 ℃水浴 15 min (7.5 min 时翻转 6-8 次混匀)。

    3. 5000 rpm 离心 40 s 弃上清, ddH2O 400 µL 重悬,离心 30 s 弃上清。

    4. ddH2O 50 µL 重悬, 涂板 SD/-Leu/-Trp 平板, 30 ℃培养 3-5 d(同时,将 Y187 阳阴性菌株于 SD/-Leu/-Trp 平板划线活化)。

    5.  实验组和对照组的设置参考表 2。

     2  转化的实验组和对照组

    实验组

    照组 1*

    对照组 2**

    Y187[p53-His2+ AD-p53]

    Y187[p53-His2+ AD- Empty]

    Y187[Empty pHis2+ AD-p53]

    Y187[pBait1-His2+ AD-Prey1]

    Y187[pBait1-His2+ AD- Empty]

    Y187[Empty pHis2+ AD-Prey1]

    Y187[pBait2-His2+ AD-Prey2]

    Y187[pBait2-His2+ AD- Empty]

    Y187[Empty pHis2+ AD-Prey2]

    Y187[pBait3-His2+ AD-Prey3]

    Y187[pBait3-His2+ AD- Empty]

    Y187[Empty pHis2+ AD-Prey3]

    注: 对照组 1*可以更好的体现实验组是否互作。对照组 2**诱饵菌株可以是 Y187[Mutant Bait pHis2]也可 以是 Y187[Empty pHis2],可以避免诱饵序列突变(或无诱饵) 的情况下,猎物直接激活报告基因而造成的假阳性, 这种假阳性并不多见,可以省略。

     

    3.2  阳性克隆鉴定

    此步骤可以省略。详细步骤可参考 SK2420 酵母阳性克隆快速检测试剂盒,本试剂盒包含猎物 AD 引物,诱饵 BD 引物可根据实际情况设计。

     

    3.3 互作验证

    1.  上述的转化成功之后, 每个样品挑取新鲜单菌落(2-3 mm)于 1 mL 0.9% NaCl 无菌水中重悬, OD600

    调至 0.2  (也可以用 SD/-Leu/-Trp 液体培养基培养至 OD600=0.2)

    2.  再用 0.9% NaCl 依次稀释 10 倍, 100 倍, 1000 倍(即 OD600=0.2 ,0.02 ,0.002 ,0.0002)。

    3.  按照先实验组后对照组的顺序,分别点板 10  μL 于相应的 SD/-Leu/-Trp ,SD/-His/-Leu/-Trp  with  3-AT* 平板 (如果已知自激活浓度, 需加入对应的 3-AT 浓度),参考图 1。

    4. 30 ℃培养 2-3 d,观察每组重组酵母在对应的自激活 3-AT 浓度平板上生长状况,从而确定是否互作。

     

    互作验证分析

    4.1 互作

    由图 1 可知,在 SD/-Leu/-Trp 平板上,对照组 Y187[p53-His2+pGADT7-p53]和 Y187[p53-His2+pGADT7] 长势相同。在 SD/-His/-Leu/-Trp  with  3-AT(25  mM)平板上, Y187[p53-His2+pGADT7-p53]长势明显优于 Y187[p53-His2+pGADT7],所以 p53-His2 与 pGADT7-p53 具有互作。同理, Bait1 和 Prey1 也有互作。

     

    4.2 Prey 蛋白有毒性

    由图 1   可 知 , 在 SD/-Leu/-Trp  平 板 上 , Y187[pBait2-His2+pGADT7-Prey2] 长 势 弱 于 对 照 组 Y187[pBait2-His2+pGADT7],可能是 Prey 蛋白有毒性导致;但是在 SD/-His/-Leu/-Trp with 3-AT(25mM)和 SD/-His/-Leu/-Trp    with    3-AT(50mM)  平 板 上 ,  Y187[pBait2-His2+pGADT7-Prey2]  长 势 优 于

    Y187[pBait2-His2+pGADT7],所以 Bait2 与 prey2 有互作。

    注: 酵母杂交互作验证实验,不适于毒性很强的 Prey 蛋白。

     

    4.3 无互作

     

    由图 1 可知,在所有的 SD 平板上,Y187[pBait3-His2+pGADT7-Prey3]/Y187[pBait3-His2+pGADT7]和 Y187[pBait4-His2+pGADT7-Prey4]/Y187[pBait4-His2+pGADT7]长势都相同,所以 Bait3 与 prey3 ,Bait4 与prey4 均无互作

     

    4.4 Bait 有自激活

    Y187[pBait5-His2+pGADT7-Prey5] Y187[pBait5-His2+pGADT7]在所有的 3-AT(50mM)平板上长势均 相同,所以 Prey5 具有自激活。

     

     

    Y187[pBait3-His2+pGADT7] SD/-Leu/-Trp Bait3

    Y187[pBait5-His2+pGADT7]能够在 SD/-His/-Leu/-Trp with 3-AT (50mM)平板上长势相同,说明 Bait5 具有一定的自激活。

    五、注意事项

    1. 本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗,食品及化妆品等用途。

    2. 为了您的安全和健康,请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。

    3. 请注意无菌操作,避免微生物污染。

     

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