Y187-pHis2 系统酵母单杂互作验证试剂盒
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Y187-pHis2 系统酵母单杂互作验证试剂盒
cat:huayueyuang7732
产品组成：
组成
产品
产品名称
规格
成分一
常温储存
培养基
SD/-Trp with Agar (备用)
0.5L
SD/-Leu/-Trp with Agar
0.5L×4
SD/-His/-Leu/-Trp with Agar
0.5L×3
成分二
-20℃储存
筛选剂
3-AT (2.5M，过滤除菌)
5×5mL
鉴定试剂盒
酵母阳性克隆快速检测试剂盒
20T
质粒
pGADT7-Rec2 质粒
10μg
pHis2 质粒
10μg
成分三
-80℃储存
对照菌株
Y187[p53-His2] (备用)
0.2mL
Y187[p53-His2+pGADT7-p53]
0.2mL
Y187[p53-His2+pGADT7]
0.2mL
感受态细胞
Y187 感受态细胞
20×100μL/支
注：
1. 本试剂盒可用于 10 对单杂互作验证 (质粒除外)。
2. 注意每个成份的保存温度， 感受态细胞务必-80℃保存。
3. 0.5L×2 表示： 2 个包装， 每个包装 0.5L；5×1mL 表示： 1 个包装，含 5 个 1mL。
4. 对照菌株的最佳 3-AT 浓度参考网站菌株说明书。
5. 本方案不适用大批量酵母单杂交实验，因为诱饵自激活检测和毒性验证应该预先完成。
产品说明：
Y187 菌株是 GAL4 系统酵母单双杂实验常用菌株，MATα 型，可直接转化质粒或与 MATa 型酵母菌 株(Y2HGold，AH109 等) 通过 mating 操作进行筛库实验。 筛选标志为：trp1，leu2，报告基因为：lacZ ， MEL1 。Y187-pHis2 系统酵母单杂需要 pHis2 和 pGADT7-Rec 两种质粒配套使用。质粒 pHis2 的筛选标志 为 TRP，用于表达 pBait-His2 construct (1~3 个 bait DNA 序列重复串联后克隆到 pHis2 中)；质粒 pGADT7的筛选标志为 LEU，用于表达 AD(GAL4 C 端 768~881 位氨基酸)与目标蛋白(Prey)的融合蛋白。Y187-pHis2系统酵母单
杂原理：当猎物蛋白(Prey) 结合到诱饵序列(Bait DNA) 上，GAL4 AD 就会激活
下游报告基 因 HIS3 的表达，能够在含有 3-AT 的培养基上生长，从而确定 DNA 和蛋白有相互。
本方案中检测诱饵酵母菌株的 3-AT 最佳使用浓度和互作验证都采用了稀释点板的方法，与涂板的方 法相比， 点板法能更直观的体现出 DNA 和蛋白的互作， 还能减少培养基和 3-AT 的使用量。本方案还对常 见的酵母单杂结果进行了分析。
目录
一、实验耗材和试剂--------- -----------2
二、菌株使用与保存---------------------3
三、实验方法---------------------------3
3.1 Bait 和 Prey 共转化 Y187-----------3
3.2 阳性克隆鉴定----------------------4
3.3 互作验证---------------------------4
四 互作验证分析------------------------5
4.1 互作-------------------------------5
4.2 Prey 蛋白有毒性--------------------5
4.3 无互作-----------------------------5
4.4 Bait 有自激活----------------------6
五、注意事项---------------------------7
本试剂盒提供的产品以产品组成为准，部分试剂和耗材需要自备，也可以在本公司单独购买。
1. 灭菌的枪头 (1000 μL、200 μL、10 μL)、涂布棒或玻璃珠，Φ90 mm 培养皿，备用。
2. Carrier DNA 在 95- 100 ℃水浴 5 min，后快速冰浴，可再重复一次，备用。
4. 自备 0.9%生理盐水，可用 ddH2O 无菌水代替，备用。
5. 普通平板制备
将 1 条培养基溶于 0.5 L 去离子水中，无需调节 pH 值，高压灭菌(如，115 ℃灭菌 20 min)。液体培养基 4 ℃ 冰箱保存； 固体培养基， 20-25 mL/块倒平板(Φ90 mm)，凝固后 4 ℃冰箱保存。
6. 特殊平板制备
SD/-His/-Leu/-Trp with Agar (3-AT)：将一条 SD/-His/-Leu/-Trp with Agar 培养基溶于 500 mL 去离子水， 无 需调节 pH 值，高压灭菌(如，115 ℃灭菌 20 min)，冷却至 50 ℃左右，每 25 mL 固体培养基，按照表 1 加入 3-AT，混匀倒平板 25 mL/块 (Φ90 mm)，凝固后于 4 ℃冰箱保存。
表 1 不同浓度 3-AT 平板
培养基体积 (mL)
25
25
25
25
25
25
3-AT (2.5 M)加入量 (μL)
50
100
300
500
800
1000
5
10
30
50
80
100
二、菌株使用与保存
1. 挑取甘油保存的对照菌液 (10-50 μL)于 SD 平板上划线， 28-30 ℃培养 3-5 d，培养出来的单菌落可直 接用于互作验证实验。
2. 挑取上述单菌落于 SD 液体培养基中， 200 r/min、28-30 ℃振荡培养 2 d，OD600 应大于 1，取 1 mL 菌液 集菌，弃上清，加入 0.2 mL 15%甘油， -80 ℃可长期保存。
注： Y187[p53-His2+pGADT7-p53]和 Y187[p53-His2+pGADT7]用 SD/-Leu/-Trp 培养基， Y187[p53-His2]用 SD/-Trp 培养基。
三、实验方法
Y187-pHis2 系统酵母单杂互作验证实验方案较多，本公司根据多年经验，给出一个较优方案， 首先我 们将自激活检测和毒性验证放在互作检测之后 (本方案不作分析)。略过载体构建，分为三个步骤： Bait 和 Prey 共转化 Y187 ，阳性克隆鉴定，互作验证。 此外，本方案还对常见的互作验证结果进行了分析。
3.1 Bait 和 Prey 共转化 Y187
AD-Prey、AD- Empty、pBait-His2 、p53-His2 和 Empty pHis2 空载(或 Mutant Bait pHis2)测序后，将其大肠杆菌菌液进行扩大培养， 然后提取质粒。
1. 取 100 µL 冰上融化的 Y187 感受态细胞(货号：CC306)，依次加入预冷的质粒 Bait 和 Prey(各 1-2 µg)， Carrier DNA 10 µL (95- 100 ℃ ，5 min，快速冰浴，重复一次)，PEG/LiAc 500 µL 并吸打几次混匀， 30 ℃ 水浴 30 min (15 min 时翻转 6-8 次混匀)。
2. 将管放 42 ℃水浴 15 min (7.5 min 时翻转 6-8 次混匀)。
3. 5000 rpm 离心 40 s 弃上清， ddH2O 400 µL 重悬，离心 30 s 弃上清。
4. ddH2O 50 µL 重悬， 涂板 SD/-Leu/-Trp 平板， 30 ℃培养 3-5 d(同时，将 Y187 阳阴性菌株于 SD/-Leu/-Trp 平板划线活化)。
5. 实验组和对照组的设置参考表 2。
表 2 共转化的实验组和对照组
实验组
对照组 1*
对照组 2**
Y187[p53-His2+ AD-p53]
Y187[p53-His2+ AD- Empty]
Y187[Empty pHis2+ AD-p53]
Y187[pBait1-His2+ AD-Prey1]
Y187[pBait1-His2+ AD- Empty]
Y187[Empty pHis2+ AD-Prey1]
Y187[pBait2-His2+ AD-Prey2]
Y187[pBait2-His2+ AD- Empty]
Y187[Empty pHis2+ AD-Prey2]
Y187[pBait3-His2+ AD-Prey3]
Y187[pBait3-His2+ AD- Empty]
Y187[Empty pHis2+ AD-Prey3]
注： 对照组 1*可以更好的体现实验组是否互作。对照组 2**诱饵菌株可以是 Y187[Mutant Bait pHis2]也可 以是 Y187[Empty pHis2]，可以避免诱饵序列突变(或无诱饵) 的情况下，猎物直接激活报告基因而造成的假阳性， 这种假阳性并不多见，可以省略。
3.2 阳性克隆鉴定
此步骤可以省略。详细步骤可参考 SK2420 酵母阳性克隆快速检测试剂盒，本试剂盒包含猎物 AD 引物，诱饵 BD 引物可根据实际情况设计。
3.3 互作验证
1. 上述的转化成功之后， 每个样品挑取新鲜单菌落(2-3 mm)于 1 mL 0.9% NaCl 无菌水中重悬， OD600
调至 0.2 (也可以用 SD/-Leu/-Trp 液体培养基培养至 OD600=0.2)。
2. 再用 0.9% NaCl 依次稀释 10 倍， 100 倍， 1000 倍(即 OD600=0.2 ，0.02 ，0.002 ，0.0002)。
3. 按照先实验组后对照组的顺序，分别点板 10 μL 于相应的 SD/-Leu/-Trp ，SD/-His/-Leu/-Trp with 3-AT* 平板 (如果已知自激活浓度， 需加入对应的 3-AT 浓度)，参考图 1。
4. 30 ℃培养 2-3 d，观察每组重组酵母在对应的自激活 3-AT 浓度平板上生长状况，从而确定是否互作。
四 互作验证分析
由图 1 可知，在 SD/-Leu/-Trp 平板上，对照组 Y187[p53-His2+pGADT7-p53]和 Y187[p53-His2+pGADT7] 长势相同。在 SD/-His/-Leu/-Trp with 3-AT(25 mM)平板上， Y187[p53-His2+pGADT7-p53]长势明显优于 Y187[p53-His2+pGADT7]，所以 p53-His2 与 pGADT7-p53 具有互作。同理， Bait1 和 Prey1 也有互作。
4.2 Prey 蛋白有毒性
由图 1 可 知 ， 在 SD/-Leu/-Trp 平 板 上 ， Y187[pBait2-His2+pGADT7-Prey2] 长 势 弱 于 对 照 组 Y187[pBait2-His2+pGADT7]，可能是 Prey 蛋白有毒性导致；但是在 SD/-His/-Leu/-Trp with 3-AT(25mM)和 SD/-His/-Leu/-Trp with 3-AT(50mM) 平 板 上 ， Y187[pBait2-His2+pGADT7-Prey2] 长 势 优 于
Y187[pBait2-His2+pGADT7]，所以 Bait2 与 prey2 有互作。
注： 酵母杂交互作验证实验，不适于毒性很强的 Prey 蛋白。
4.3 无互作
由图 1 可知，在所有的 SD 平板上，Y187[pBait3-His2+pGADT7-Prey3]/Y187[pBait3-His2+pGADT7]和 Y187[pBait4-His2+pGADT7-Prey4]/Y187[pBait4-His2+pGADT7]长势都相同，所以 Bait3 与 prey3 ，Bait4 与prey4 均无互作。
4.4 Bait 有自激活
Y187[pBait5-His2+pGADT7-Prey5]和 Y187[pBait5-His2+pGADT7]在所有的 3-AT(50mM)平板上长势均 相同，所以 Prey5 具有自激活。
注 ： Y187[pBait3-His2+pGADT7] 仅 在 SD/-Leu/-Trp 平 板 上 生 长 ， 说 明 Bait3 无 自 激 活 。
Y187[pBait5-His2+pGADT7]能够在 SD/-His/-Leu/-Trp with 3-AT (50mM)平板上长势相同，说明 Bait5 具有一定的自激活。
五、注意事项
1. 本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗，食品及化妆品等用途。
2. 为了您的安全和健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。
3. 请注意无菌操作，避免微生物污染。
