Y187-pHis2 系统酵母单杂筛库试剂盒
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Y187-pHis2 系统酵母单杂筛库试剂盒
cat:huayueyang00213
产品组成：
组成
产品
产品名称
规格
成份一
常温储存
培养基
YPDA Broth
0.5L×1
YPDA with Agar
0.5L×1
SD/-Trp Broth
0.5L×1
SD/-Trp with Agar
0.5L×1
SD/-Leu/-Trp with Agar
0.5L×1
SD/-His/-Trp Agar
0.5L×2
SD/-His/-Leu/-Trp with Agar
0.5L×6
成份二
-20℃储存
筛选剂
3-AT (2.5M，过滤除菌)
5×5mL
鉴定试剂盒
酵母阳性克隆快速检测试剂盒
200T
转化试剂盒
Super 酵母感受态制备与转化试剂盒 Plus
200T
质粒
pGADT7-Rec2 质粒
10μg
pHis2
10μg
成份三
-80℃储存
对照菌株
Y187[p53-His2]
0.2mL
Y187[p53-His2+pGADT7-p53]
0.2mL
Y187[p53-His2+pGADT7]
0.2mL
感受态细胞
Y187 感受态细胞
20×100μL/支
注：
1. 本试剂盒可用于一次诱饵筛库实验 (质粒除外)。
2. 注意每个成份的保存温度， 感受态细胞务必-80 ℃保存。
3. 规格 0.5L×2 表示： 2 个包装，每个包装 0.5L；规格 5×1mL 表示： 1 个包装， 含 5 个 1mL。
4. 对照菌株的最佳 3-AT 浓度参考网站菌株说明书。
产品说明：
Y187 菌株是 GAL4 系统酵母单双杂实验常用菌株，MATα 型，可直接转化质粒，也可以与 MATa 型 酵母菌株(Y2HGold，AH109 等) 通过 mating 操作进行筛库实验。筛选标记为：trp1，leu2，报告基因为： lacZ ，MEL1。Y187-pHis2 系统酵母单杂需要 pHis2 和 pGADT7-Rec2 两种质粒配套使用。质粒 pHis2 的筛 选标志为 TRP，用于表达 pBait-His2 construct (1~3 个 bait DNA 序列重复串联后克隆到 pHis2 中)；质粒 pGADT7-Rec2 的筛选标志为 LEU，用于表达 AD(GAL4 C 端 768~881 位氨基酸)与目标蛋白(Prey)的融合蛋白。 Y187-pHis2 系统酵母单杂原理： 当猎物蛋白(Prey) 结合到诱饵序列(Bait DNA) 上， GAL4 AD就会激活 HIS 的表达， 能够在含有 3-AT 的培养基上生长， 从而确定 DNA 和蛋白有相互作用。
本公司根据多年经验， 结合本公司的单杂培养基套装、感受态制备和阳性
克隆鉴定等试剂盒， 对筛库 的操作流程进行了优化。本方案在 pBait-His2 和文库质粒载体构建已完成的基础上进行撰写，分为三个步 骤： 构建诱饵酵母菌株， 筛选诱饵菌株的 3-AT 最佳使用浓度， 制备 Y187[pBait-His2]感受态与筛选 cDNA文库， 最后是对阳性克隆的确认与互作分析，即单杂互作验证。
目录
一、实验耗材和试剂--------------------------------------------2
二、菌株使用与保存--------------------------------------------3
三、实验方法--------------------------------------------------3
3.1 构建诱饵酵母菌株(pBait-His2 转化 Y187)--------------------4
3.2 筛选诱饵酵母菌株的 3-AT 最佳使用浓度----------------------4
3.3 制备 Y187[pBait-His2]感受态与筛选 cDNA 文库---------------4
四、阳性克隆的确定与互作分析----------------------------------6
4.1 筛选阳性克隆----------------------------------------------6
4.2 互作克隆鉴定----------------------------------------------7
4.2.1 文库质粒回转验证----------------------------------------7
4.2.2 转录因子全长重新构建 pGADT7 载体回转验证----------------7
五、注意事项--------------------------------------------------8
一、实验耗材和试剂
本试剂盒提供的产品以产品组成为准，部分试剂和耗材需要自备，也可以在本公司单独购买。
1. 灭菌的枪头 (1000 μL、200 μL、10 μL)、涂布棒或玻璃珠，Φ90 mm 培养皿，备用。
2. Carrier DNA 在 95- 100 ℃水浴 5 min，后快速冰浴，可再重复一次，备用。
4. 自备 0.9%生理盐水，可用 ddH2O 无菌水代替，备用。
5. 普通平板制备
将 1 条培养基溶于 0.5 L 去离子水中，无需调节 pH 值，高压灭菌(如，115 ℃灭菌 20 min)。液体培养基 4 ℃ 冰箱保存；固体培养基， 20-25 mL/块倒平板(Φ90 mm)， 或 70-75 mL/块倒平板(Φ150 mm)，凝固后 4 ℃冰箱保存。
6. 特殊平板制备
SD/-His/-Leu/-Trp with Agar (3-AT)：将一条 SD/-His/-Leu/-Trp with Agar 培养基溶于 500 mL 去离子水， 无 需调节 pH 值， 高压灭菌(如， 115 ℃灭菌20 min)，冷却至 50 ℃左右， 参照表 1 加入 3-AT，倒平板 25 mL/ 块(Φ90 mm)，凝固后于 4 ℃冰箱保存。
表 1 不同浓度 3-AT 平板
培养基体积 (mL)
25
25
25
25
25
25
3-AT (2.5M)加入量 (μL)
50
100
300
500
800
1000
3-AT 终浓度 (mM)
5
10
30
50
80
100
二、菌株使用与保存
1. 挑取甘油保存的对照菌液(10-50 μL)于 SD 平板上划线， 28-30 ℃培养 3-5 d，培养出来的单菌落可直 接用于互作验证实验。
2. 挑取上述单菌落于 SD 液体培养基中， 200 r/min、28-30 ℃振荡培养 2 d，OD600 应大于 1，取 1 mL 菌液 集菌，弃上清，加入 0.2 mL 15%甘油， -80 ℃可长期保存。
注： Y187[p53-His2+pGADT7-p53]和 Y187[p53-His2+pGADT7]用 SD/-Leu/-Trp 培养基， Y187[p53-His2]用 SD/-Trp 培养基。
三、实验方法
对于 Y187-pHis2 系统酵母单杂筛库，常用的方法有两种：
a. 先将诱饵质粒转进酵母Y187，做诱饵质粒自激活，再将诱饵质粒和文库质粒共转到同一种酵母Y187。
b. 先将诱饵质粒转进酵母 Y187，做诱饵质粒自激活，再将诱饵菌株制备成感受态后将文库质粒转入。
根据实验条件和操作习惯选择一种方法即可，只要操作和 BD 构建没有问题都不会影响筛库的效率，实验流程差异只在于 3.3 制备 Y187[pBait-His2]感受态与筛选 cDNA 文库，本方案为第一种。
3.1 构建诱饵酵母菌株(pBait-His2 转化 Y187)
1 取 100 µL 冰上融化的 Y187 感受态细胞(货号：CC306)，依次加入预冷的质粒 5 μL(2-5 µg)，Carrier DNA 10 µL (95- 100 ℃，5 min，快速冰浴，重复一次)，PEG/LiAc 500 µL 并吸打几次混匀， 30 ℃水浴 30 min (15 min 时翻转 6-8 次混匀)。
2 将管放 42 ℃水浴 15 min (7.5 min 时翻转 6-8 次混匀)。
3 5000 rpm 离心 40 s 弃上清， ddH2O 400 µL 重悬，离心 30s 弃上清。
4 ddH2O 50 µL 重悬，涂板 SD/-Trp 平板， 30℃培养 3-5 d。
注： 同时将 Y187 阳阴性菌株于 SD 平板划线活化。
3.2 筛选诱饵酵母菌株的 3-AT 最佳使用浓度
对于不同的诱饵片段，其 3-AT 最佳使用浓度不同，因此， 需要筛选每个诱饵酵母菌株的 3-AT 最佳使 用浓度，具体步骤如下。
1. 上述的转化验证成功之后， 每个样品挑取新鲜单菌落(2-3 mm)于 1 mL 0.9%氯化钠溶液中重悬，OD600 调至 0.002 (也可以用 SD/-Trp 液体培养基培养至 OD600=0.002)。
2. 取 100 μL 菌液分别涂布到 SD/-Trp 平板和含不同 3-AT 浓度的 SD/-His/-Trp 平板上， 30 ℃培养 2-3 d；
3. 观察诱饵酵母在不同 3-AT 浓度平板上生长状况， 从而确定 3-AT 最佳使用浓度。
注： 在不同浓度 3-AT 平板上(0 ，10mM ，20mM ，30mM ，40mM ，50mM ，60mM ，70mM ，80mM)，出 现的酵母菌斑最少或完全没有，即为 3-AT 最佳使用浓度 (最
佳抑菌浓度、最小抑菌浓度、本底表达浓度、 自激活浓度)。一般情况下筛库自激活 3-AT 浓度不宜超过 80mM。
3.3 制备 Y187[pBait-His2]感受态与筛选 cDNA 文库
酵母菌株 Y187 含有 Leu2-3 基因， 在生理状态下该基因处于抑制状态， 不能合成亮氨酸， 所以诱饵酵母菌株不能在缺亮氨酸的培养基(SD/-Leu)上生长。文库 cDNA 载体 pGADT7 含有 LEU2 基因，当文库质粒成功转入诱饵酵母菌株时，诱饵酵母能够在缺亮氨酸的培养基(SD/-Leu)上生长。当文库中的猎物 蛋白与诱饵片段互作时， 激活选择报告基因 His 的表达，从而互作的酵母菌株能够在
SD/-His/-Leu/-Trp/3-AT*培养基上正常生长。
1. 挑取鉴定成功的Y187[pBait-His2]单菌落接种到含有 3 mL SD/-Trp 液体培养基的 15 mL 摇菌管中。30 ℃， 200 rpm 过夜培养。
2. 将 3 mL 小摇菌体(上步小摇所得) 接到含有 50 mL 液体 SD/-Trp 培养基的三角瓶中继续培养， 待 OD600 达到 0.4-0.5 ，3000 rpm 离心 5 min ，弃上清。
3. 用 10 mL Y1 溶液重悬沉淀， 3000 rpm 离心 5 min ，弃上清。
4. 加入 600- 1000 μL Y2 溶液重悬， 转文库按 600 μL 分装， 转质粒按 100 μL 分装，可直接用于转化或冷冻 保存。
注： 制备好的感受态细胞需缓慢冷冻后，再置于-80 ℃冰箱长期保存。将感受态细胞放入程序降温盒，或 用多层纸包裹放入泡沫盒中，先置于-80 ℃冰箱过夜后， 再取出感受态置于-80 ℃冰箱， 可保存一年。使用 前室温融化后用于转化。
5. 取上述 Y187[pBait-His2]感受态细胞 600 µL 于冰上，依次加入预冷的 15 μg cDNA 文库质粒(约 30 μL)、 2520 μL Y3 溶液，轻柔吸打混匀， 30 ℃水浴 90 min (每 10 min 时翻转 6-8 次混匀)。对于部分菌种， 延长 孵育时间可提高转化效率，但不要超过 3 小时。
注： 文库质粒加入量与文库质量有关， 可根据实际情况加入。 建议用 ddH2O 补充体积， 将质粒与 Y3 溶液 的体积定容为 2.6 mL。
6. (可选步骤)用 3 mL YPD Plus Liquid Medium 重悬沉淀，30 ℃摇床震荡培养 90 min，3000 rpm 离心 5 min， 弃上清。
7. 3000 rpm 离心 5 min，弃上清。 加入 15 mL 0.9%氯化钠溶液重悬菌体， 涂筛选培养基平板。
注： 上述为酵母大规模转化，将文库质粒转化进诱饵酵母菌株中；同时做小规模转化，将 pGADT7 和 pGADT7-53 转化 Y187[p53-His2]作为阴、阳对照，均涂布在 SD/-Leu/-Trp。本是试剂盒已包含阴阳性对照 菌， 在相应的培养基上划线培养即可。
8. 取上一步的 50 µL 重悬菌体，按 1/10 、1/100 、1/1000 比例稀释，各取 100 μL 菌液于 SD/-Trp、SD/-Leu 和 SD/-Leu/-Trp 三种平板(Φ90 mm)涂布。
9. 剩余重悬菌体，每 150 μL 涂布于 SD/-His/-Leu/-Trp/3-AT*平板(Φ150 mm)。
注： 总共 15 mL，每板 150 μL 可涂布 100 块。每板可以适当增加重悬菌体量， 减少平板数量， 建议 35- 100块平板（Φ150 mm）。与自激活浓度相比，筛库 3-AT*浓度应高出 5 mM，且在 50-100mM 之间。
10. 30 ℃培养 3-5 d，统计 SD/-Leu/-Trp (Φ90 mm)平板上单菌落数目，计算文库筛选克隆数。
文库筛选克隆数= [cfu/mL on SD/-Leu/-Trp]×[稀释倍数]×[重悬体积 (15 mL)]
转化效率=克隆细胞数×悬浮体积（mL）×稀释倍数×[涂板子体积（mL）×总 DNA 的量（μg）] -1
注：SD/-Leu/-Trp 平板上，至少要有 1.0×106个克隆，如果克隆数较少，会降低筛选到阳性克隆的概率。
SD/-Leu/-Trp/3-AT*平板上，克隆数非常少往往与诱饵序列和文库质量有关。有研究表明 30 万个克隆也能筛选到阳性克隆。
四、阳性克隆的确定与互作分析
4.1 筛选阳性克隆
1. 复筛活化菌株
（可选步骤）将筛选得到的单菌落于 SD/-His/-Leu/-Trp/3-AT*平板划线，2-4 d 能够生长的菌落再用于后续验证。
注：此步骤选做，与下面的 3.复筛鉴定互作酵母菌株有重复。
2. 菌落 PCR 鉴定互作酵母菌株
选择直径约为 2~3 mm 的克隆，菌落 PCR 扩增，引物为 pGADT7-F/R，PCR 体系和程序参见酵母阳性克隆快速检测试剂盒。
3. 复筛鉴定互作酵母菌株
电泳条带大于 400 bp（根据实验目的和实际情况而定）的单菌落，划线于 SD/-His/-Leu/-Trp/3-AT*培养基上，30℃培养 2-4 d。有多条电泳条带的单菌落（含有多个质粒的转化子），需要在SD/-His/-Leu/-Trp/3-AT*筛选培养基上重复划线培养 2-3 代，然后通过菌落 PCR 的方法选出具有单个质粒的克隆.
4.2 互作克隆鉴定
互作克隆鉴定也称点对点互作验证或回转验证。在回转验证实验中，AD 载体有两种形式，文库质粒或互作基因 CDS 片段重新构建 pGADT7 质粒，都可以用于验证实验。可以参考本公司的 Y187-pHis2 系统酵母单杂筛库试剂盒，这里仅做简要描述。
将上述 PCR 产物送公司测序，使用 BLAST 序列比对工具在线分析阳性克隆的测序结果，根据测序和序列比对结果，将与数据库中转录因子同源性高的阳性克隆的文库质粒，提取质粒后重新转化Y187[pBait-His2]菌株。或通过 NCBI 在线 Blast 分析转录因子 CDS，然后根据其对应的引物，以 cDNA 为模板（建库时的 cDNA），扩增转录因子全长，重新构建 pGADT7 载体，并转化 Y187[pBait-His2]菌株。
4.2.1 文库质粒回转验证
1. 用 SD/-Leu/-Trp 液体培养基摇阳性酵母克隆菌株，离心收集菌体并提取文库质粒。如果阳性克隆超过60 个，方法参见 96 孔一步法酵母质粒小提试剂盒（货号：PE056）；如果阳性克隆少于 60 个，方法参见 一步法酵母质粒小
提试剂盒。
2. 从酵母中提取的文库质粒转入 E.coli 感受态细胞，转化液全部涂布在含 Amp 的 LB 培养基上，37℃培养 16 h。每个样品取 3-5 个克隆（重复）进行菌液 PCR 鉴定。
3. 挑取鉴定成功的单菌落摇菌，提取大肠杆菌中的文库质粒，方法参见市场上常用的质粒小提试剂盒说明书。
4. 将提取的文库质粒转入诱饵酵母菌株 Y187[pBait-His2]为实验组，pGADT7 空转入 Y187[pBait-His2]为对照组，可以更好的体现实验组是否互作。文库质粒转入 Y187[Mutant Bait pHis2]，可以避免诱饵序列突变（或无诱饵）的情况下，猎物直接激活报告基因而造成的假阳性，这种假阳性并不多见，可以省略如表 2 表 3。
5. 文库质粒转化诱饵菌株，快速离心转化液，0.9%的氯化钠溶液分别悬浮转化菌体，涂布 SD/-Leu/-Trp 培养基上，30℃培养 3-5 d。
6. 取转化后的重组子菌落，重悬于 0.9%的氯化钠溶液中，将 OD600 调至 0.2、0.02、0.002、0.0002。分别取100 μL 菌悬液涂布于 SD/-His/-Leu/-Trp/3-AT*和 SD/-Leu/-Trp 培养基上，30℃倒置培养 3-5 d，观察菌落生长情况，如表 2 表 3。
注：上述为涂板法验证酵母杂交互作，梯度稀释点板法可参考本公司的 Y1HGold 单杂互作验证试剂盒。
7. 将转化后的重组子酵母进行 PCR、测序、比对分析（或提取质粒、PCR、测序、比对分析），方法同上。
4.2.2 转录因子全长重新构建 pGADT7 载体回转验证
以 cDNA 为模板（建库时的 cDNA），扩增转录因子全长，重新构建 AD-Prey（pGADT7-Rec2 载体）， 并转化 Bait 菌株。方法同上，验证结果如表 2 表 3。
五、注意事项
1. 本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗，食品及化妆品等用途。
2. 为了您的安全和健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。
3. 请注意无菌操作，避免微生物污染。
