Y1HGold单杂筛库试剂盒

 

Y1HGold单杂筛库试剂盒

cat:huayueyang0372

 

产品组成

组成	产品	产品名称	规格
成份一 常温储存	培养基	YPDA Medium	0.5Lx1
		SD/-Ura with Agar	0.5Lx2
		SD/-Ura Broth	0.5Lx1
		SD/-Leu with Agar	0.5Lx10
		SD/-Leu Broth	0.5Lx1
成份二 -20℃储存	筛选剂	金担子素A(AbA，1mg/mL)	1mL
	鉴定试剂盒	酵母基因组菌落PCR 试剂盒	20T
		酵母阳性克隆快速检测试剂盒	200T
	转化试剂盒	Super酵母感受态制备与转化试剂盒Plus	200T
	质粒	pGADI7 质粒	10ug
		pAbAi 质粒	10ug
成份三 -80℃储存	对照菌株	YIHGold[p53-AbAi]菌株(备用)	0.2mL
		YIHGold(p53-AbAi+pGADT7-p53]菌株	0.2mL
		YIHGoldp53-AbAi+pGADT71菌株	0.2mL
	感受态细胞	YIHGold 感受态细胞	20x100uL/支

 

注：

1. 本试剂盒可用于一次诱饵筛库实验(质粒除外)，如需要单独采购某个组分，请联系本公司。
2. 注意每个成份的保存温度，感受态细胞务必-80。C保存。
3. 规格 0.5Lx2 表示: 2个包装，每个包装 0.5L；规格 5xlmL 表示: 1个包装，含5个lmL。

4.对照菌株的最佳 AbA 浓度参考网站菌株说明书。

 

产品说明:

YIHGold-GAL4-AbA 醇母单杂系统使用的菌株 YIHGold 是 MATa型，可直接转化质粒进行筛库试验筛选标记为: ura3，leu2; 报告基因为: AbAr。

YIHGold-GAL4-AbA 酵母单杂系统需要 pAbAi和pGADT7 两种质粒配套使用。质粒 pAbAi 的筛选标惠为URA,用于表达pBait-AbAi construct (l-3 个bait DNA序列重复事联后克隆到pAbAi中);质粒pGADT7的筛选标志为LEU,用于表达 AD(GAL4 C  768-881位氨基酸)与目标蛋白(Prey)的融合蛋白。GAL4-AbA醇母单杂系统原理: Aureobasidin A(AbA)是一种环脂肤抗生素，在低浓度(0.1-0.2 ug/mL)下即可对醇母产生毒性。基因组中整合了pBait-AbAi 的酵母菌株 (Bait-Reporter Yeast Strains)，当猎物蛋白 (Prey) 结合到诱饵序列 (Bait DNA) 上，GAL4 AD 就会激活 AbAr 的表达，从而能够在含有抗生素 AbA 的培养基上生长。AbAr 与营养缺陷报告基因相比具有更低背景的优点，可以降低酵母单杂假阳性发生的极率。

 

 

本公司根据多年经验，结合本公司的单杂培养基套装、感受态制备和酸母基因组菌落 PCR 等试剂盒对筛库的操作流程进行了优化。本方案在 pBait-AbAi 和文库质粒载体构建已完成的基础上进行撰写，分为三个步骤: 构建诱饵母菌株，筛选诱饵菌株的 AbA 最佳使用浓度，制备 YIHGold[pBait-AbAi]感受态与筛选cDNA 文库，本方法还对阳性克隆的确认与互作进行了分析，即单杂互作验证。

 

目录

实验耗材和试剂-----------------------------------------------------------------------------------2

菌株使用与保存-----------------------------------------------------------------------------------3

实验方法---------------------------------------------------------------------------------------------3

3.1 构建诱饵酵母菌株 (pBait-AbAi 转化 Y1HGold)-----------------------------------3

3.1.1 pBait-AbAi 质粒线性化-------------------------------------------------------------------3

3.1.2 pBait-AbAi 转化 YIHGold-----------------------------------------------------------------4

3.1.3 诱饵菌株鉴定-------------------------------------------------------------------------------4

3.2 筛选诱饵酵母菌株的 AbA 最佳使用浓度--------------------------------------------5

3.3 制备 Y1HGold[pBait-AbAi]感受态与始选 cDNA 文库-----------------------------5

四、阳性克隆的确定与互作分析-------------------------------------------------------------6

4.1 筛选阳性克隆----------------------------------------------------------------------------------6

4.2 互作克隆鉴定----------------------------------------------------------------------------------7

4.2.1 文库质粒回转验证-------------------------------------------------------------------------7

4.2.2 转录因子全长重新构建 pGADT7 载体回转验证---------------------------------8

.五、注意事项---------------------------------------------------------------------------------------8

 

一：实验耗材和试剂

本试剂盒提供的产品以产品组成为准，部分试剂和耗材需要自备，也可以在本公司单独购买。

1.灭菌的枪头(1000uL、200uL、10uL)、涂布或玻璃珠，Ø90 mm 或Ø150 mm 培养皿，备用。

2.Carrier DNA 在 95-100℃水浴 5 min，后快速冰浴，可再重复一次，备用。

3 稀释金担子素:取 100uL AbA(l mg /mL)于 900uL 无水乙醇中稀释,充分混匀,即AbA浓度为 100 ug/ mL.4℃冰箱中备用(稀释 10 倍后使用，有利于在培养基中混匀，建议按用量稀释)。

4.自备 0.9%生理盐水，可用 ddH₂O 无菌水代替，备用。

5.普通平板制备

将 1条培养基溶于 0.5 L 去离子水中，无需调节 pH值，高压灭菌(如，115℃灭菌 20min)。液体培养基 4℃冰箱保存:固体培养基，20-25 mL/块倒平板 (Ø90 mm)或 70-75 mL/块倒平板 (Ø150 mm)，凝固后4℃冰箱保存。

6.特殊平板制备

SD/-Leu (AbA)或 SD-Ua (AbA): 将一条 SD-Leu with Aar 培养基溶于 500 mL 去离子水中，无需调节pH 值，高压灭菌(如，115℃灭菌 20 min)，冷却至

 

 

50℃左右，参照表 1 加入稀释后的金担子素(AbA),倒平板 20 mL/块(Ø 90 mm)，凝固后于 4℃冰箱保存。

 

表 1. 不同AbA 浓度的平板

培养基体积(mL)	20	20	20	20	20	20	20
AbA(100 ug/mL)加入量(uL)	0	20	40	60	100	140	200
AbA 终浓度(ng/mL)	0	100	200	300	500	700	1000

 

二、菌株使用与保存

1.挑取一环甘油保存的菌液(10-50ul ) 于 SD 平板上划线，28-30℃培养 3-5 d，培养出来的单菌落可直接用于互作验证实验。

2.挑取上述单南落于 SD 液体培养基中，200 r/min、28-30℃振荡培养2d，OD₆₀₀应大于1，取 1mL 菌液集菌，弃上清，加入 0.2 mL 15%甘油，-80℃可长期保存。

注: Y1HGold[p53-AbAi+pGADT7-p53]和 Y1HGold[p53-AbAi+pGADT7]用 SD/-Leu 培养基，Y1HGold[p53-AbA]用 SD/-Ura 培养基。

 

三、实验方法

3.1 构建诱饵酵母菌株 (pBait-AbAi 转化 Y1HGold)

3.1.1 pBait-AbAi 质粒线性化

pBai-AbAi、p53-AbAi 和 Empty pAbAi 空 (或 Mutant Bait pAbAi) 测序后，将其大肠杆菌菌液进行扩大培养，然后提取质粒。用 Bstb 限制性内切酶 (NEB) 进行线性化处理。

 

选饵载体酶切体系

组分	体积
BstB I	4-10uL
质粒 DNA	4-10ug
10xBuffer	20-50uL
无酶 ddH20	补充至 200-500uL

 

65℃酶切 2h，0.8%的琼脂糖跑胶，检测载体是否酶切完全，纯化回收。要求回收后质粒浓度>100 ng/uL。

注: Empty pAbAi 空载 (或 Mutant Bait pAbAi) 线性化后转入 YIHGold，作为可选对照组。

 

3.1.2 pBait-AbAi 转化 Y1HGold

1. 取 100u L 冰上融化的 YIHGold 感受态细胞 ，依次加入预冷的线性化质粒 5 uL(2-5 ug),Carrier DNA 10 uL (95-100℃，5 min，快速冰浴，重复一次)，PEG/LiA 500uL 并吸打几次混匀，30℃水浴 30 min (15 min 时翻转 6-8 次混匀)。

2. 将管放 42℃水浴 15 min (7.5 min 时翻转 6-8 次混匀)。

3. 5000rpm 离心40s 弃上清，ddH₂0 400uL 重悬，离心 30s 弃上清。

 

4. ddH₂0 50uL 重悬，涂板 SD-/Ura 平板，30℃培养 3-5 d。

注: 同时将 YIHGod 阳阴性菌株于 SD 平板划线活化。

 

3.1.3 诱饵菌株鉴定

1.准备 PCR 预混液:根据检测克降数，等比例扩大配制体积。

试剂	50 uL 反应体系
高保真 PCRMix	44uL
YIH 引物混合物(或其它上下游引物)	1uL (各0.5 uL)

 

2.吸取 5uL 醇酵母快速裂解液加入 PCR 管中。

3.用无菌牙签或 10 uL 枪头刮取筛选出来 SD/-Ura 固体培养基上的单落 (直径 1-2 mm，刮取 1/4 即可)悬浮在裂解液中。

4.吹打或者震荡混匀后使用 PCR 仪 98℃裂解 5min，即为裂解产物。

5.在裂解产物中加入 45uL PCR 预混液 (含引物)，PCR扩增。PCR 反应条件: 98℃3 min: 98℃ 10s,60℃30 s，72℃ 1 min (15-30 s/kb) : 72℃ 5 min。35 个循环。

6.将 PCR 产物于1%琼脂糖凝胶电泳并测序验证。

注:

本公司提供的酵母基因组菌落 PCR 试剂盒中 YIH 引物混合物(未公开序列)扩增空 pAbAi 重组YIHeGold 的产物为 1346 bp。测序可以用 pAbAiF (GCTCCTTCCTICGTTCTICCTTC)，或插入片段的特异性引物。

用 1%的琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 扩增产物，鉴定阳性克隆，消除假阳性 (PCR 分析结果应为: 阳性对照.1.4 kb;阴性对照.无条带:诱饵菌株.1.35 kb+insert size)。

 

3.2 筛选诱饵酵母菌株的 AbA 最佳使用浓度

诱饵酵母菌株在没有 Prey 体存在情况下,其基本 AbA 表达量非常低。对于不同的诱饵片段,其 AbA*最佳使用浓度不同。因此，需要筛选每个诱饵酵母菌株的 AbA 最佳使用浓度，具体步骤如下。

1.上述的转化验证成功之后，每个样品挑取新鲜单南落(2-3 mm)于1 mL 0.9%氯化钠溶液中重悬，OD600调至 0.002(也可以用 SD/-Ura 液体培养基培养至 OD600-0.002)。

2.取 100 uL 菌液分别涂布到含不同 AbA 浓度的 SD/-Ura 平板上，30℃培养 2-3 d。

3.观察诱饵酵母在不同 AbA 浓度平板上生长状况，从而确定 AbA 最佳使用浓度。

注: 在不同浓度 AbA 平板上 (0, 100 ng/ mL, 200 ng /mL, 300 ng/mL， 500 ng/ mL, 700 ng/ mL，1000 ng/ mL),出现的醇母菌斑最少或完全没有，即为 AbA 最佳使用浓度(最佳抑菌浓度、最小抑菌浓度、本底表达浓度、自激活浓度)。一般情况下筛库自激活 AbA 浓度不宜超过 800 ng/mL。

 

3.3 制备 Y1HGold[pBait-AbAi]感受态与筛选 cDNA 文库

酵母菌株 YIHGold 含有 Lcu2-3 基因，在生理状态下该基因处于抑制状态，

 

不能合成亮氨酸，所以诱饵醇母茵株不能在缺亮氨酸的培养基 (SD/-Leu) 上生

长。文库 cDNA 体 pGADT7 含有 LEU2 基因，当文库质粒成功转入诱饵醇母菌株时，诱饵酵母能够在缺亮氨酸的培养基 (SD-Le)上生长。当文库中的猎物蛋白与诱饵片段互作时，激活诱饵酵母中的 AbA 抗性基因(AURI-C)，从而互作的酵母菌株能够在SD/-Leu/AbA*培养基上健康生长。

1.挑取鉴定成功的 YIHGoldpBait-AbAi]单菌落接种到含有 3 mLYPDA 液体培养基的 15mL 摇菌管中。30°C，200 pm 过夜培养。

2.将3 mL 小摇菌体(上步小摇所得)接到含有 50mL 液体 YPDA 培养基的三角瓶中继续培养，待 OD600达到 0.4-0.5，3000rpm 离心 5 min，弃上清。(4℃保存1周内的酵母液，用3mL 接种 50mL YPDA 培养基过夜培养亦可)。

3.用 10 mL Y1 溶液重悬沉淀，3000 rpm 离心 5 min，弃上清。

4.加入 600-1000uL Y2 溶液重悬，转文库按 600uL 分装，转质粒按 100uL 分装，可直接用于转化或冷冻保存。

注:制备好的感受态细胞需缓慢冷冻后，再置于-80℃冰箱长期保存。将感受态细胞放入程序降温盒，或用多层纸包裹放入泡沫盘中，先置于-80℃冰箱过夜后，再取出感受态置于-80℃冰箱，可保存一年。使用前室温融化后用于转化。

5.取上述 Y1HGoldlpBait-AbAi]感受态细胞 600uL 于冰上，依次加入预冷的 15-25ug cDNA 文库质粒(约30uL)、2520uL Y3 溶液，轻柔吸打混匀，30℃水浴 9 min(每隔 10 min 翻转 6-8 次混匀)对于部分菌种延长孵育时间可提高转化效率，但不要超过 3 小时。

注:文库质粒加入量与文库质量有关，可根据实际情况加入。建议用 ddH2O 补充体积，将质粒与 Y3 溶液的体积定容为 2.6 mL。

6. (可选步骤) 3000pm 离心 5 min，弃上清。用 3 mL YPD Phs Liquid Medium 重悬沉淀，30℃摇床震荡培养 90 min。

7.3000 rpm 离心 5 min，弃上清。加入 15 mL 0.9%氯化销溶液重悬菌体，涂筛选培养基平板。注: 上述为醇母大规模转化，将文库质粒转化进诱饵酵母菌株中;同时做小规模转化将 PGADT7 和pGADT7-53 转化 YIHGold[p53-AbA]作为阴、阳对照，涂布在 SD/-Leu。本试剂盒已包含阳性对照菌，在相应的培养基上划线培养即可。

8.取上一步的 50uL重悬菌体,按 1/10、1/100、1/1000 比例稀释,各取 100 uL 菌液于SD-Leu,SD/-Leu/AbA*两种平板 (Ø90 mm)涂布。

9.剩余重悬菌体，每 150 uL 涂布于 SD/-Leu/AbA*平板(Ø150 mm)。

注: 总共 15 mL，每板 150 uL 可涂布 100 块。每板可以适当增加重悬菌体量，减少平板数量，建议 35-100块平板 (Ø150mm)。与自激活浓度相比，筛库平板 AbA*浓度应高出 50 ng/mL。

10.30℃培养 3-5 d，统计 SD/-Leu (Ø90 mm)平板上单菌落数目，计算文库筛选克隆数。文库筛选克隆数=[cfu/mL on SID/-Leu]×[稀释倍数]×[重悬体积(15 mL)]转化效=克降细胞数×悬浮体积 (mL)×稀倍×[板子体积 (mL) ×总 DNA 的量 (ug)]^-1 。

注: SD-Leu 平板上，至少要有 1.0×10⁶ 个克隆，如果克隆数较少，会降低筛选到阳性克隆的概率。SD/-Leu/AbA*平板上，非常少克隆数往往与诱饵序列和文库质量有关。有研究表明 30 万个克隆也能筛选到阳性克隆。

 

 

四、阳性克隆的确定与互作分析

4.1 筛选阳性克隆

1.复筛活化菌株

(可选步骤)将筛选得到的单菌落于 SD/-Lew/AbA*平板划线，2-4 d 能够生长的菌落再用于后续验证注:此步骤选做，与下面的 3.复筛鉴定互作酵母菌株有重复。

2.菌落 PCR 警定互作酵母菌株

选择直径约为 2-3 mm 的克隆，菌落 PCR 扩增，引物为pGADT7-F/R，PCR 体系和程序参见酵母阳性克隆快速检测试剂盒。

3.复筛鉴定互作酵母菌株

电泳条带大于 400 bp(根据实验目的和实际情况而定)的单菌落，划线于 SD/-Leu/AbA*培养基上,30 ℃培养 2-4 d。有多条电泳条带的单菌落(含有多个质粒的转化子)，需要在 SD/-Leu/AbA*筛选培养基上重复划线培养 2-3 代，然后通过菌落 PCR 的方法选出具有单个质粒的克隆。

 

4.2 互作克隆鉴定

互作克隆鉴定也称点对点互作验证或回转验证。在回转验证实验中，AD 载体有两种形式，文库质粒或互作基因 CDS 片段重新构建 GADT7 质粒，都可以用于验证实验。可以参考本公司的 YIHGold 单杂互作验证试剂盒，这里仅做简要描述。

将上述 PCR 产物送公司测序，使用 BLAST 序列比对工具在线分析阳性克隆的测序结果，根据测序和序列比对结果，将与数据库中转录因子同源性高的阳性克隆的文库质粒，提取质粒后重新转化Y1HGold[pBait-AbAi菌株。或通过 NCBI 在线 Blast 分析转录因子 CDS，然后根据其对应的引物，以 cDNA为模板(建库时的 cDNA)，扩增转录因子全长，重新构建 PGADT7 载体，并转化 YIHGoldlpBait-AbAi]菌株。

 

4.2.1 文库质粒回转验证

1.用 SD/-Leu 液体培养基摇阳性母克隆菌株，离心收集菌体并提取文库质粒。如果阳性克隆超过 60 个，方法参见 96 孔一步法酵母质粒小提试剂盒；如果阳性克隆少于 60 个，方法参见一步法醉母质粒小提试剂盒。

2.从酵母中提取的文库质粒转入 E.coli 感受态细胞，转化液全部涂布在含 Amp 的 LB 培养基上，37℃培养 16 h。每个样品取 3-5 个克降(重复) 进行菌液 PCR 鉴定。

3.挑取鉴定成功的单菌落摇菌，提取大肠杆菌中的文库质粒，方法参见""公司的质粒小提试剂盒说明书。

4.提取的文库质粒转入 YIHGold[pBait-AbAi]为实验组。pGADT7 空载体转入 YIHGold[pBait-AbAi]对照组，可以更好的体现实验组是否互作。文库质粒转入 YIHGold[Mutant Bait pAbAi]，可以避免诱饵序列突变(或无诱饵)的情况下，猎物直接激活报告基因而造成的假阳性，这种假阳性并不多见，可以省略如表2表3。

5.文库质粒转化诱饵菌株，快速离心转化液中，0.9%的氯化纳溶液分别悬浮转化菌体，涂布 SD/Leu 培养基上，30℃培养 3-5 d。

 

6.取转化后的重组子菌落，重悬于0.9%的氯化钠溶液中，将 OD600 调至 0.2、0.02、0.002、0.0002。分别取 100uL 菌悬液涂布于 SD/-Leu/AbA*和 SD/-Leu 培养基上，30℃倒置培养 3-5 d，观察菌落生长情况，如表2 表3。

注:上述为涂板法验证酵母杂交互作，梯度稀释点板法可参考本公司的 YIHGold 单杂互作验证试剂盒。

7.将转化后的重组子酵母进行 PCR、测序、比对分析(或提取质粒、PCR、测序、比对分析)，方法同上。

 

4.2.2 转录因子全长重新构建 pGADT7 载体回转验证

以cDNA 为模板(建库时的cDNA)，扩增转录因子全长，重新构建 pGADT7 载体，并转化 Bait 菌株方法同上，验证结果如表 2 表 3。

 

表2.阳性

Sample	Selective Agar Plate	Distinct 2 mm Colonies
Y1HGold [Bait/AbAi] +AD Prey	SD/-Leu	Yes
	SD-Leu/AbA*	Yes
Y1HGold [Bait/AbAi] +AD	SD-Leu	Yes
	SD-Lcu/AbA*	No (or very small)
YIHGold [Mutant/AbAi] +AD Prey	SD/-Leu	Yes
	SD-Leu/AbA*	No (or very small)

 

表3.假阳性

Sample	Selective Agar Plate	Distinct 2 mm Colonies
Y1HGold [Bait/AbAi] +AD Prey	SD/-Leu	Yes
	SD-Lcu/AbA*	Yes
Y1HGold [Mutant/AbAi] +AD Prey	SD/-Leu	Yes
	SD-Lcu/AbA*	Yes

 

 

 

五、注意事项

1. 本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗，食品及化妆品等用途。

2.为了您的安全和健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。

3.请注意无菌操作，避免微生物污染。