羟脯氨酸(HYP)含量检测试剂盒
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羟脯氨酸(HYP)含量检测试剂盒
可见分光光度法
hyys098-50T
产品组成:
组分
规格
保存
提取液
自备试剂
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试剂一
液体 15 mLx1瓶
4℃保存
试剂二
液体 15 mLx1瓶
4℃保存
标准品
液体 1 mLx1支
4℃保存
溶液的配制:
1.提取液:自备6mol/L盐酸溶液，大约需要100mL，常温保存;试剂盒内提供一个30mL 棕色空瓶，仅做分装使用，请自行标注试剂名称
2.6mol/L 盐酸提取液的配制:按浓盐酸(37%)和H20的体积比是1:1进行配制。
3.标准品:0.5 mg/mL羟脯氨酸标准品。
产品说明:
HYP是机体胶原蛋白主要成分之一，胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等,因此 HYP 含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。
样本经酸水解产生游离的 HYP,进一步被氯胺T氧化,氧化产物与对二甲氨基苯甲醛反应,产生红色化合物，在 560nm 处有特征吸收峰。通过测定样本水解液 560nm 吸光值，可计算 HYP 含量。
技术指标:
最低检出限:0.051 μg/mL
线性范围:0.117-15 μg/mL
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
天平、玻璃管、离心机、水浴锅、可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、6mol/L 盐酸、氢氧化钠溶液和蒸馏水。
操作步骤:
- 样本处理(可适当调整待测样本量)
- 组织:称取约 0.2g样本于 EP管，将组织尽量剪碎以便消化，盖子稍松不密闭。加入2m的提取液，煮沸或110℃烘箱2至6小时消化至没有可见大的团块(缠封口膜，防止爆盖)，冷却后用NaOH溶液(10mol/L 的大约需要 1mL)调节 pH值至6-8范围内(不可过酸或过碱),再蒸馏水定容至4mL。最后16000rpm,25℃,离心 20min(若离心后仍有杂质，可通过过滤去除)，取上清待测。
2.细菌/细胞:取 5x106 个细菌/细胞，加入 1mL 的提取液，煮沸或110℃烘箱2至6小时消化至透明状(缠封口膜，防止爆盖)，冷却后用 NaOH 溶液(10mol/L 的大约需要 0.5mL)调节 pH值至 6-8范围内(不可过酸或过碱),蒸馏水定容至 2mL，16000rpm，25℃，离心20min，取上清待测。
3.液体样本:称取300μL液体样本于EP管，加入0.7mL的提取液(若测定数值过小可调整二者比例)，煮沸或110℃烘箱2至6小时消化至没有可见大的团块(缠封口膜，防止爆盖)，冷却后用NaOH溶液调节 pH 值至6-8范围内(不可过酸或过碱)，再蒸馏水定容至2mL。最后16000rpm，25℃，离心20min(若离心后仍有杂质，可通过过滤去除)，取上清待测。
注:提取过程中可能有黑色物质生成，若长时间不能消化，可能为碳化的物质，不影响实验。
二、测定步骤
1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至560nm，蒸馏水调零。
2、将 0.5 mg/mL 羟脯氨酸标准品用蒸馏水稀释为15、7.5、3.75、1.875、0.938、0.469、0.234、0.117μg/mL 标准品。
3、标准品稀释表:
序号
稀释前浓度(μgmL)
标准液体积(μL)
蒸馏水体积(μL)
稀释后浓度(μg/mL)
1
500(即 0.5 mg/mL)
30
970
15
2
15
500
500
7.5
3
7.5
500
500
3.75
4
3.75
500
500
1.875
5
1.875
500
500
0.938
6
0.938
500
500
0.469
7
0.469
500
500
0.234
8
0.234
500
500
0.117
备注:下述实验中每个标准管需200μL标准品(注意不要在此步直接检测吸光度)。
- 按下表进行操作:
试剂名称
空白管
测定管
标准管
样本(μL)
-
200
-
标准品(μL)
-
-
200
试剂一(μL)
200
200
200
混匀，常温静置 20min
试剂二(μL)
200
200
200
蒸馏水(μL)
600
400
400
混匀，60℃，水浴 20min，取出后常温静置 15 min，用 1mL 玻璃比色皿，在 560nm 下分别测定空白管、测定管、标准管的吸光值，记为A空白管、A 测定管、A标准管，计算ΔA 测定=A 测定管-A 空白管，ΔA 标准=A标准管-A空白管。标准曲线和空白管只需做1-2次。
三、羟脯氨酸含量计算公式
1.标准曲线的绘制:
以标准品的浓度为x轴，ΔA 标准为y轴，绘制标准曲线，得到方程 y=kx+b。将ΔA 测定带入方程得到x(ug/mL).
2羟脯氨酸含量的测定:
(1)按样本质量计算:
组织羟脯氨酸含量(μg/g质量)=X×V样本÷(W×V样本÷V组提)×F=4x÷W×F
(2)按样本蛋白浓度计算:
组织羟脯氨酸含量(μg/mg prot)=X×V样本÷(Cpr×V样本)×F =X÷Cpr×F
(3)按细菌或细胞数量计算:
细胞羟脯氨酸含量(μg/106 cell)=X×V样本÷(N×V 样本÷V 胞提)×F =2X÷N×F
- 按液体体积计算:
液体羟脯氨酸含量(μg/mL)=X×V液提÷V 液体×F=6.67×X×F
V样本:加入的样本体积，0.2mL;V组提:组织提取液体积，4mL;V胞提:细胞提取液体积，2mL;V液提:液体提取液体积，2mL;V液体:前处理中液体加入体积，0.3mL:W:样本质量，g:N:细胞数量，以106为单位，百万个;Cpr:样本蛋白质浓度，mg/mL。
注意事项:
1、如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以增加样太量或者用蒸馏水稀释样本后再进行测定。
2、试剂有一定的毒性，请操作时做好防护措施，防止吸入或与皮肤接触。
3、按样本蛋白浓度计算时，需单独提取样本中的蛋白质并测定。
实验实例:
1、取 0.2g小鼠皮肤进行样本处理，取上清后蒸馏水稀释 32 倍后按测定步骤操作，使用 1mL 玻璃比色皿测得计算 ΔA 测定=A 测定管-A 空白管-0.548-0.124=0.424,带入标准曲线y=0.0634x+0.0044,R2-0.9996,计算 x=6.62,按样本质量计算含量得:
组织羟脯氨酸含量(μg/g质量)=4x÷W×32(稀释倍数)=4×6.62-0.2×32-4236.8μg/g质量。
2、取 8×106个 HMC-1细胞进行样本处理,取上清后按测定步骤操作,使用1mL 玻璃比色皿测得计算 ΔA 测定=A测定管-A空白管=0.245-0.124=0.121，带入标准曲线y=0.0634x+0.0044，R2=0.9996，计算x=1.84，按细胞数量计算含量得:
细胞羟脯氨酸含量(μg/106cell)=2x÷N=2×1.84÷8=0.46 μg/106 cell。
3、取 300μL牛血清进行样本处理，取上清后按测定步骤操作，使用1mL 玻璃比色皿测得计算 ΔA 测定=A 测定管-A 空白管=0.243-0.124=0.119,带入标准曲线y=0.0634x+0.0044,R2=0.9996，计算x=1.81，按液体体积计算含量得:
液体羟脯氨酸含量(μg/mL)=6.67×x=6.67×1.81=12.07 μg/mL。
