多酚氧化酶（PPO）活性检测试剂盒
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多酚氧化酶（PPO）活性检测试剂盒
可见分光光度法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
规格：50T/24S cat:hyysb08-50
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系华越洋工作人员。
溶液的配制：
1、 提取液：临用前将粉剂一倒入提取液中，溶液为悬浊液，使用前需摇匀。
产品简介：
PPO（EC1.10.3.1）是一种广泛存在于植物体内的含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化产生醌，从而引起褐化，与果蔬加工、茶叶品质和组培等密切相关。
PPO 能够催化邻苯二酚产生邻苯二醌，后者在 410nm 有特征光吸收。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1. 收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率 200W，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10 分钟，取上清，置冰上待测。
2. 称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10 分钟，取上清，置冰上待测。
3. 血清（浆）：直接检测。若有浑浊请离心后去上清使用。
二、测定步骤 1、 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 410nm，蒸馏水调零。
2、 样本测定（在 EP 管中依次加入下列试剂）
37℃(哺乳动物)或 25℃（其它物种）中准确水浴 10min 后，迅速放入沸水中加热 10min。冷却后，5000g，常温离心 10min，收集上清，410nm 处检测测定管和对照管吸光度，计算 ΔA=A 测定-A 对照。
注意：每个测定管需要设置一个对照管，可以在不同对照管中加入不同样本的粗酶液，然后集中进行 5min 沸水浴处理。
三、PPO 活性计算
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每分钟每 mg 组织蛋白在每 mL 反应体系中使 410nm 处吸光值变化 0.01 定义为一个酶活力单位。
PPO 活性（U/mg prot）= ΔA÷0.01×V 反总÷（Cpr×V 样）÷T =60×ΔA÷Cpr
（2）按样本质量计算：
单位的定义：每分钟每 g 组织在每 mL 反应体系中使 410nm 处吸光值变化 0.01 定义为一个酶活力单位。
PPO 活性（U/g 质量）=ΔA÷0.01×V 反总÷（W÷V 样总×V 样）÷T =60×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞数量计算：
单位的定义：每分钟每 1 万个细菌或细胞在每 mL 反应体系中使 410nm 处吸光值变化 0.01 定义为一个酶活力单位。
PPO 活性（U/104cell）= ΔA÷0.01×V 反总÷（500÷V 样总×V 样）÷T =0.12×ΔA
V 反总：反应体系总体积，0.9mL；V 样：加入反应体系中样本体积，0.15mL；V 样总：加入提取液体积， 1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞数量，500 万；T：反应时间，10min。
注意事项：
不同样本的多酚氧化酶最佳的反应温度略有差别，可在 25-37℃之间进行调节。
