EGY48-LacZ 系统酵母单杂互作试剂盒

EGY48-LacZ 系统酵母单杂互作验证试剂盒

HYYKB07-10T

 

产品组成：

组成	产品	产品名称	规格
成分一	培养基	SC/-Ura with Agar（备用）	0.5L
		SD/-Trp/-Ura Broth（备用）	0.5L
		SD/-Trp/-Ura with Agar	0.5L×2
成分二	验证试剂盒	LacZ 基因胞外表达显色试剂盒	50P
	质粒	pB42AD(PJG4-5)质粒	2μg
		pLaczi 质粒	2μg
	对照菌株	EGY48 单杂阳性菌	0.2mL
成分三	感受态细胞	EGY48 感受态细胞	20×100μL/支

 

注：

1. 本试剂盒提供的产品以产品组成为准，大概能用于 10 对双杂互作验证（质粒除外）。

2. 各组分需按照标签温度储存，感受态细胞务必-80 ℃保存。

3. 0.5L×2 表示：2 个包装，每个包装 0.5L；5×1mL 表示：1 个包装，含 5 个 1mL。

4. pLacZi 是否酶切线性化之后转入 EGY48，根据实际情况而定（我司 pLaczi 不需要线性化转入酵母）。

5. EGY48 单杂阳性菌是我司构建的，仅供参考。

6. 感受态细胞 CC302 配带有 Carrier DNA 和 PEG/LiAc。

 

产品说明：

EGY48 酵母菌可用单双杂实验，转化质粒进行互作验证或筛库试验。筛选标记为：his3，trp1，ura3。 EGY48-LacZ 酵母单杂系统需要 pB42AD 和 pLacZi两种质粒配套使用。质粒 pB42AD 的筛选标记为 TRP1，用于表达 AD(来自疱疹病毒的 88 个氨基酸残基组成的 B42AD 蛋白)与目标蛋白(Prey)的融合蛋白。质粒 pLacZi 的筛选标志为 URA3，报告基因为 LacZ，只有当 Bait 和 Prey 互作时才能启动 LacZ 表达，在显色培养基上显蓝色，从而确定 DNA 和蛋白有相互。

本方案结合 LacZ 基因胞外表达显色试剂盒进行互作验证，采用稀释点板的方法，与涂板的方法相比，更能直观的体现出 DNA 和蛋白的互作，还能减少培养基的使用。另外，本方案还对常见的酵母单杂结果进行了分析。

 

一、实验耗材和试剂

本试剂盒提供的产品以产品组成为准，部分试剂和耗材需要自备，也可以在本公司单独购买。

1. 灭菌的枪头（1000 μL、200 μL、10 μL）、涂布棒或玻璃珠，Φ90 mm 培养皿，备用。

2. Carrier DNA 在 95-100 ℃水浴 5 min，后快速冰浴，可再重复一次，备用。

3. 自备 0.9%生理盐水，可用 ddH2O 无菌水代替，备用。

4. 普通平板制备

将 1 条培养基溶于 0.5 L 去离子水中，无需调节 pH 值，高压灭菌（如，115 ℃灭菌 20 min）。液体培养基 4 ℃ 冰箱保存；固体培养基，20-25 mL/块倒平板（Φ90 mm），凝固后 4 ℃冰箱保存。

6. 显色平板配置

参考  LacZ 基因胞外表达显色试剂盒说明书。

 

二、菌株使用与保存 

2.1 冻干粉溶解

可选择将冻存管中冻干粉全部溶解或部分溶解

1. 全部溶解

取一整管冻干粉，加入 200 μL 无菌水或无菌培养基溶解，重悬后即可得 200 μL 菌悬液，直接用于菌株活 化，剩余菌液-80℃冰箱保存（建议分装保存，注意避免反复冻融）。

2. 部分溶解

用枪头刮取管中冻干粉，用无菌水或无菌培养基溶解，直接用于菌株活化，剩余冻干粉-80℃保存。

2.2 菌株活化

取 2.1 中冻干粉溶解得到的菌液 10-50 μL 至 SD/-Trp/-Ura 培养基（平板）上进行划线。置于培养箱 28-30℃

培养 3-5 d。培养出来的单菌落可直接用于互作验证实验。

2.3 菌株保存

挑取上述单菌落于 SD/-Trp/-Ura 液体培养基中，200 r/min、28-30℃振荡过夜培养，OD600 应大于 1，取 1 mL

菌液集菌，弃上清，加入 0.2 mL 15%甘油，-80℃可长期保存。

 

三、实验方法 

EGY48-LacZ 系统酵母单杂互作验证实验方案较多，本公司根据多年经验，给出一个较优方案，首先我们将自激活检测，毒性验证放在互作检测之后（本方案不作分析）。略过载体构建，分为三个步骤：Bait 和 Prey 共转化 EGY48，阳性克隆鉴定，互作验证。本方案仅适用于酵母小规模转化，大规模转化，请先做自激活和毒性实验，此外，本方案还对常见的互作验证结果进行了分析。

3.1 Bait 和 Prey 共转化 EGY48

AD-Prey、AD-Empty、pBait-LacZi 和 Empty pLacZi 空载（或 Mutant Bait pLacZi）测序后，将其大肠杆菌菌液进行扩大培养，然后提取质粒。

1. 取 100 µL 冰上融化的 EGY48 感受态细胞，依次加入预冷的质粒 Bait 和 Prey（各 1-2 µg），

Carrier DNA 10 µL（95-100 ℃，5 min，快速冰浴，重复一次），PEG/LiAc 500 µL 并吸打几次混匀，30 ℃ 水浴 30 min (15 min 时翻转 6-8 次混匀)。

2. 将管放 42 ℃水浴 15 min (7.5 min 时翻转 6-8 次混匀)。

3. 10,000 rpm 离心 30 s 弃上清，ddH2O 400 µL 重悬，离心 30 s 弃上清。

4. ddH2O 50 µL 重悬，涂板 SD/-Trp/-Ura 平板，30 ℃培养 3-5 d（同时，将 EGY48 阳阴性菌株冻干粉溶解后，于 SD/-Trp/-Ura 平板划线活化）。

5. 实验组和对照组的设置参考表 1。

表 1 共转化的实验组和对照组

实验组	对照组 1*	对照组 2**
EGY48[Positive LacZi+ Positive AD]	EGY48[Positive LacZi+ AD- Empty]	EGY48[Mutant Bait pLacZi+ Positive AD]
EGY48[pBait1-LacZi+ AD-Prey1]	EGY48[pBait1-LacZi+ AD- Empty]	EGY48[Mutant Bait pLacZi+ AD-Prey1]
EGY48[pBait2-LacZi+ AD-Prey2]	EGY48[pBait2-LacZi+ AD- Empty]	EGY48[Mutant Bait pLacZi+ AD-Prey2]
EGY48[pBait3-LacZi+ AD-Prey3]	EGY48[pBait3-LacZi+ AD- Empty]	] EGY48[Mutant Bait pLacZi+ AD-Prey3]

 

注：对照组 1*可以更好的体现实验组是否互作。对照组 2**诱饵菌株是 EGY48[Mutant Bait pLacZi]，可以避免诱饵序列突变（或无诱饵）的情况下，猎物直接激活报告基因而造成的假阳性，这种假阳性并不多见，可以省略。

3.2 阳性克隆鉴定

此步骤可以省略。详细步骤可参考 SK2420 酵母阳性克隆快速检测试剂盒，引物可根据实际情况设计。

3.3 互作验证

1. 上述的转化成功之后，每个样品挑取新鲜单菌落（2-3 mm）于 1 mL 0.9% NaCl 溶液中重悬，OD600 调至 0.2（也可以用 SD/-Trp/-Ura 液体培养基培养至 OD600=0.2）。

2. 再用 0.9% NaCl 溶液依次稀释 10 倍，100 倍，1000 倍（即 OD600=0.2，0.02，0.002，0.0002）。

3. 按照先实验组后对照组的顺序，分别点板 10 μL 于相应的 SD/-Trp/-Ura 和 SD/-Trp/-Ura/Gal/Raf/X-Gal 平板，参考图 1。

4. 30 ℃培养 2-3 d，观察每组重组酵母在平板上生长状况和颜色深浅，从而确定是否互作。

注：如果，梯度稀释点板在 SD/-Trp/-Ura 平板上生长正常，在 SD/-Trp/-Ura/Gal/Raf/X-Gal 平板上生长缓慢或不能生长，可能是酵母菌利用半乳糖作为碳源的能力较弱导致。建议增加过渡培养的步骤：利用 3mL SD/-Trp/-Ura 液体培养基（含 0.5%葡萄糖和 2%半乳糖），摇菌至 OD600 大于 0.5，5000 rpm 离心 40 s 弃上清。换用 3mL SD/-Trp/-Ura 液体培养基（0.1%葡萄糖，2%半乳糖），摇菌至 OD600 大于 0.5，5000 rpm 离心 40 s 弃上清。无菌水清洗一次。无菌水重悬菌液，然后梯度点板（参考上述）。

 

互作验证分析 

4.1 互作

由图 1 可知，在 SD/-Trp/-Ura 平板上，对照组 EGY48[Positive LacZi+ Positive AD]和 EGY48[Positive LacZi+AD]长势相同。在 SD/-Trp/-Ura/Gal/Raf/X-Gal 平板上，EGY48[Positive LacZi+ Positive AD]长势明显优于 EGY48[Positive LacZi+AD]，且显蓝色，所以 Positive LacZi 与 Positive AD 具有互作。同理，Bait1 和 Prey1也有互作。

4.2 无互作

由 图 1 可知， EGY48[pBait2-LacZi+AD-Prey2] /EGY48[pBait2-LacZi+AD] 和

EGY48[pBait3-LacZi+AD-Prey3] /EGY48[pBait3-LacZi+AD]在所有的 SD 平板上，长势都相同，所以 Bait2 与 Prey2 无互作，Bait3 与 Prey3 无互作。

4.3 Prey 蛋白有毒性

由 图 1 可知，在 SD/-Trp/-Ura 平板上， EGY48[pBait4-LacZi+AD-Prey4] 长势弱于对照组 EGY48[pBait4-LacZi+AD]，可能是 Prey 蛋白有毒性导致；但是在 SD/-Trp/-Ura/Gal/Raf/X-Gal 平板上， EGY48[pBait4-LacZi+AD-Prey4]长势优于 EGY48[pBait4-LacZi+AD]，且显蓝色，所以 Bait4 与 Prey4 有互作。

注：酵母杂交互作验证实验，不适于毒性很强的 Prey 蛋白。

 

4.4 Bait 有自激活

EGY48[pBait2-LacZi+AD-Prey2]和 EGY48[pBait2-LacZi+AD]在所有的在 SD 平板上长势均相同，且能够显蓝色，所以 Prey2 具有较强的自激活。EGY48[pBait5-LacZi+AD-Prey5]和 EGY48[pBait5-LacZi+AD]在 SD/-Trp/-Ura 平板上长势相同，在 SD/-Trp/-Ura/Gal/Raf/X-Gal 平板上，实验组组较对照组的颜色更深，所以 Bait5 和 Prey5 有互作，虽然 Bait5 也有一定的自激活。

图 1.点板互作验证结果示意图

 

五、注意事项

载体注意事项：

1. 建议收到质粒后请先转化感受态（克隆菌株），再挑选单菌落重新提取后使用。

2. 转化前请准确查找该质粒对应的抗生素、抗生素浓度、感受态（克隆菌株）和培养温度。

3. 如有必要请测序后使用，我司网站检索对应货号可下载质粒图谱。

 

培养基注意事项：

1. 一般情况下 pH 值不必调节，建议测定一下 pH5.8±0.2 即可。

2. SD 培养基可能溶解不彻底或灭菌后有少量沉淀，不影响实验进行。

3. SD 培养基灭菌后，颜色为白色至浅黄色。

 

感受态注意事项：

1. 一支感受态不建议分成两份使用。

2. 如果转化效率低，只有几个单克隆，建议做 PCR 鉴定。

3. 筛选出来的单克隆，一般是圆形凸起、边缘整齐、表面光滑湿润、不透明、乳白色-浅黄-浅粉色的菌落，有酵母气味。

 

本试剂盒注意事项：

1. 本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗，食品及化妆品等用途。

2. 为了您的安全和健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。

3. 请注意无菌操作，避免微生物污染。

4. 此方案仅供参考。