MC1061F´电转感受态细胞
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MC1061F´电转感受态细胞
产品说明
[F'proAB+lacIqlacZΔM15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139Δ(araABC-leu)7679ΔlacX74 galUgalK rpsL thi
MC1061F´是主要的噬菌体展示用菌株，同时也可用于质粒构建，蛋白表达等实验，lacIqZΔM15的存在使其可以用于蓝白斑筛选等实验；但不含核酸酶endA1突变，体内核酸酶含量较高，提取质粒时推荐使用质粒提取试剂盒中去蛋白液以去除菌体内核酸酶。MC1061F´菌株具有四环素抗性。
MC1061F´电转感受态细胞
操作方法
1. 取适量SOC放37度预热1-2小时（每管感受态准备10ml SOC）。
2. 0.1 cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟沥干水分，正置5分钟，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电击杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。
3. 取-80℃保存的MC1061F´电击感受态细胞插入冰中5 分钟，待其融化，加入目的DNA (质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。
A. 测定转化效率使用1 μl 10 pg/μl的对照质粒 pUC19；
B. 对于连接产物，部分公司的T4连接酶体系或重组体系可与电击感受态混合后电击转化，无需进行DNA纯化，但DNA浓度不能过高，DNA浓度不超过100 ng/μl，体积不超过5 μl/50 μl感受态。
C. 对离子浓度较高的DNA溶液或反应体系请用膜纯化或乙醇沉淀法纯化DNA，ddH2O溶解后电击转化。
4. 用200 μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)将感受态-DNA混合物快速移到电击杯中（避免产生气泡），轻轻晃动使液面保持水平状态，盖上杯盖，插入冰中。
5. 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV，将电击杯从冰中拿出，用吸水纸擦拭表面，吸干表面水渍，放入电转槽中，电击完成后拿出电转杯放室温，打开杯盖，15秒内加入0.9ml预热的SOC（此步骤可在电转仪旁操作，无需在超净台操作），用1ml 枪吹吸电击杯底部2-3次，混匀后转移到50 ml离心管（BD Falcon 50 ml离心管等），向离心管中补加S.O.C. 培养基至10 ml。37℃，225 rpm复苏60分钟。
6. 5000 rpm离心一分钟收菌，重悬后取100-200 μl涂布到含相应抗生素的S.O.C平板上（因菌量较大，若全部涂板请选用直径15cm培养皿2-5个）。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养13-17小时。
7. 若要获得大量，高纯度质粒，建议在TB培养基中37度摇菌培养（以标准质粒PUC19为例：在TB营养液中过夜培养的菌体浓度和质粒产量为LB的3-4倍，SOB的2倍）
MC1061F´电转感受态细胞
注意事项
1. 加入DNA时体积不应大于感受态体积的1/10。
2. 电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡，气泡会增加弧光放电风险。
3. 当DNA不纯或存在盐，乙醇，蛋白及缓冲液等污染时，转化效率急剧下降。
4. 电击杯里的离子可增加溶液的电导，增大在含有细胞和DNA的溶液中产生电流和弧光放电的风险。
5. 若转化大质粒或想获得较高转化效率，推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。
6. 对于连接产物，最好用膜纯化或乙醇沉淀法纯化DNA后用适量ddH2O或TE缓冲液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重悬产物，保证DNA浓度不超过100 ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率，增加弧光放电的风险。
7. 混入质粒时应轻柔操作，吸取感受态细胞时避免用力过猛，以免剪切力过大损伤细胞膜，降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。
8. 电击感受态细胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。
MC1061F´电转感受态细胞
