ATP含量检测试剂盒 (分光光度法)
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ATP含量检测试剂盒 (分光光度法)
注意:正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
ATP广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是生物能量通货，能荷是描述细胞能量代谢状态的主要参数。测定ATP含量并且计算能荷，能够反映能量代谢状态。
ATP含量检测试剂盒测定原理:
肌酸激酶催化肌酸和ATP反应生成磷酸肌酸，可在700nm下用磷钼酸比色法检测磷酸肌酸含量，以此反应ATP含量。
ATP含量检测试剂盒测定试剂组成和配制:
酸性提取液:液体60mLx1瓶，4℃保存:
碱性提取液:液体60mLx1瓶，4℃保存:
试剂一:粉剂x1支，4℃保存;临用前加入2mL蒸馏水充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存，止反复冻融。
试剂二:液体3mLx1瓶，4℃保存;
试剂三:粉剂x1瓶，-20℃保存:临用前加入300μL蒸馏水充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂四:液体10mLx1瓶，4℃保存:
试剂五:液体50mLx1瓶，4℃保存;
标准液:液体10mLx1瓶，1μmol/mLATP标准液，4℃保存;
ATP提取:
1、血清(浆)中ATP的提取:按照血清(浆)体积(mL):酸性提取液体积(mL)为1:5~10的比例
(建议取约0.1mL血清(浆)，加入1mL酸性提取液)，进行冰浴匀浆，8000g4℃离心10min:取上清液至另一EP管中，加入等体积的碱性提取液使之中和，混匀，8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测(不可用于蛋白质含量测定)。
2、组织中 ATP 的提取:按照组织质量(g):酸性提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织，加入1mL酸性提取液)，进行冰浴匀浆，8000g4℃离心10min，取上清至另一EP管中，加入等体积的碱性提取液使之中和，混匀，8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测(不可用于蛋白质含量测定)。
3、细胞或细菌中ATP的提取:先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量(104个):酸性提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL酸性提取液)，超声波破碎1min(冰浴，强度20%或200W，超声 2s，停 1s)，8000g4℃离心10min;取上清液至另一 EP 管中，加入等体积的碱性提取液使之中和，混匀，8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测(不可用于蛋白质含量测定)。
ATP含量检测试剂盒测定测定步骤:
1、分光光度计预热30min以上，调节波长到700nm，蒸馏水调零。
2、显色剂的配制:临用前请根据拟用显色剂体积(样本数x0.87mL)，按试剂四(mL):试剂五(mL)=1:5的比例配制。用多少配多少。
3、样本测定:
试剂名称(μL) 测定管 对照管 标准管 空白管
样本 30 30
标准液 30 30
试剂一 60 60
试剂二 30 30 30 30
试剂三 10 10
蒸馏水 70 70
充分混匀，37℃准确水浴30min
显色剂 870 870 870 870
37℃水浴 20min 后，700nm下测定各管吸光值
注意:空白管和标准管通常只需要各做一个，每个测定管设一个对照管。
ATP 含量计算:
1、血清(浆)中ATP含量计算
ATP 含量(μmol/mL)=[C 标准管x(A测定管一A对照管)÷(A标准管一A空白管)xV1]÷(V3xV1÷V2)=20x(A测定管一A对照管)÷(A标准管-A空白管)
- 组织、细菌或细胞中ATP含量计算
- (1)按蛋白浓度计算
ATP含量(μmol/mg prot)=[C标准管x(A测定管一A对照管)÷(A标准管一A空白管)xV1]÷(V1÷Cpr)=1x(A测定管一A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷Cpr
蛋白质含量需要另外测定。
(2)按样本鲜重计算
ATP 含量(μmol/g 鲜重)=[C标准管x(A测定管一A对照管)÷(A标准管一A空白管) xV1]÷(WxV1÷V2)=2x(A测定管一A对照管)÷(A标准管一A空白管)÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
ATP 含量(μmol/104c次方cell)=[C标准管x(A测定管一A对照管)÷(A标准管一A空白管)xV1]÷(500xV1÷V2)=0.004x(A测定管一A对照管)÷(A标准管一A空白管)
C标准管:标准液浓度，1μmol/mL: V1:加入反应体系中样本体积，0.03mL:
V2:加入提取液体积，2mL: V3:加入血清(浆)体积:0.1mL:
Cpr:样本蛋白质浓度，mg/mL; W:样本质量，g;
500:细胞或细菌总数，500万。
ATP含量检测试剂盒测定注意事项:
最低检测限为10nmol/mL或10nmol/g鲜重或0.1nmol/mg prot
