果胶酯酶(PE)活性检测试剂盒
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果胶酯酶(PE)活性检测试剂盒
NaOH 滴定法
注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果试剂三工作液消耗量过大或过小,建议稀释或者增加样本量进行检测。
果胶酯酶(PE)活性检测试剂盒产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系工作人员。
试剂名称
规格型号
保存条件
提取液
粉剂×1 瓶
常温保存
试剂一
粉剂×1 瓶
常温保存
试剂二
液体 1.5 mL×1 支
4℃保存
试剂三
液体 10 mL×1 瓶
4℃保存
果胶酯酶(PE)活性检测试剂盒
50T 溶液的配制:
- 提取液:临用前加入 100mL 蒸馏水,充分溶解;用不完的试剂 4℃避光可保存3个月;
- 试剂一:临用前加入 100mL 蒸馏水,磁力搅拌 50℃加热溶解 3 小时左右至完全溶解,转移至 250mL 容量瓶,蒸馏水定容至 250mL;用不完的试剂 4℃可保存8周;(因试剂一较难配制,建议客户提前制备)
- 试剂三工作液:临用前根据样本量取出部分试剂三,用蒸馏水稀释16倍得到试剂三工作液备用,现配现用,用不完的试剂 4℃可保存1周;
产品说明:
果胶酯酶(Pectinesterase,PE),又称果胶甲基酯酶、果胶氧化酶,广泛存在于植物及微生物中。果胶是构成植物细胞壁的主要成分之一,而果胶酯酶催化果胶的甲氧酯水解产生果胶酸和甲醇,在植物果实成熟的细胞壁代谢过程中发挥着重要作用,在食品工业中具有极其重要的作用和开发前景。
果胶酯酶催化果胶水解的过程中释放H+,反应体系pH值降低,通过加入碱液维持反应体系pH始终维持在7.8 维持pH所消耗的碱液量可反映果胶酯酶的活性。
需自备的仪器和用品:
低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、天平、研钵/匀浆器、10mL离心管或试管、容量瓶、冰和蒸馏水。
果胶酯酶(PE)活性检测试剂盒
操作步骤:
- 样本处理
- 将研钵/匀浆器与提取液置于冰上或 4℃预冷 10min。
- 按照样本质量(g):提取液体积(mL)=1:3~5 的比例(建议称取约 0.5g 样本,加入 1.5mL 提取液)加入提取液,冰浴匀浆后,于 4℃,12000g 离心 10min,弃沉淀,取全部上清液置于冰上待测。
- 测定步骤
- 将试剂一置于37℃水浴锅中保温10min以上。
- 依次在10mL离心管或试管中加入1mL上清液、25μL试剂二和4mL试剂一,充分混匀,用试剂三工作液调节pH 至7.8(粉红色)。
- 将上述离心管或试管置于37℃恒温培养箱/水浴锅中准确反应60min,每隔20min用试剂三工作液调节pH,使其维持在7.8(粉红色),并记录下所消耗试剂三工作液的体积,记为V(mL)。
- 果胶酯酶活性计算
酶活单位定义:每g组织样本每分钟消耗1umol NaOH的量为一个酶活力单位。
PE活性(U/g 质量)=25×V÷V上清×V提÷W÷T×F=1.25×V×F
V:消耗试剂三工作液的体积,mL;V上清:加入的上清液体积,1mL;V提:加入的提取液体积,1.5mL;W: 样本质量,g;T:反应时间,60min;F:稀释倍数。
果胶酯酶(PE)活性检测试剂盒
注意事项:
- 实验中酶促反应产生 H+,此时溶液无色透明,需用试剂三调节 pH 到 7.8(粉红色),即溶液会从无色透明突然变为粉红色。
- 建议正式实验前进行预实验,其中测定步骤 2 中,将样本上清液、加入试剂二和试剂一混匀后,用试剂三工作液调节 pH 至 7.8(粉红色)时,可适当调整每次加入试剂三工作液的体积,防止pH调过。
- 若样本酶活性较高,可适当稀释样本上清液后再进行测定,计算酶活时乘以稀释倍数即可。若样本酶活性较低, 建议客户加大样本量后重新进行测定,注意同步修改计算公式。
实验实例: 称取 0.51g 苹果果肉加入 1.5mL 提取液进行冰浴匀浆,取 1mL 上清液于 10mL 离心管中按照测定步骤操作, 最终计得调节 pH 所消耗试剂三工作液总体积为 0.76mL,按样本质量计算酶活得: PE 活性(U/g 质量)=25×V÷V 上清×V 提÷W÷T=0.93 U/g 质量。
试剂名称
空白管
标准管
对照管
测定管
样本(μL)
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100
100
标准品(μL)
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100
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蒸馏水(μL)
100
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试剂一(μL)
800
800
800
800
混匀、90℃放置10min,取出后冷却
试剂二(μL)
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100
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试剂三(μL)
100
100
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100
混匀,25℃静置 30min 后测定 530nm 处吸光值,分别记为 A 空白管、A 标准管、A 对照管和 A
测定管。ΔA 标准=A 标准管-A 空白管,ΔA 测定=A 测定管-A 对照管。
果胶酯酶(PE)活性检测试剂盒