Y2HGold-GAL4系统酵母双杂互作验证试剂盒

Y2HGold-GAL4系统酵母双杂互作验证试剂盒

产品货号: hyyp8901

储存条件: 请按产品包装要求储存，有效期 1 年。

产品组分:

Y2HGold-GAL4系统酵母双杂互作验证试剂盒

注：

1. 本试剂盒可用于 10 对互作蛋白验证（质粒除外）。

2. 注意每个成份的保存温度，感受态细胞务必-80℃保存。

3. 3×0.5L 代表：3 个包装，每个包装 0.5L；5×1mL 代表：1 个包装，含 5 个 1mL。

4. 按照本试剂盒的流程操作，在最大程度上节约时间，最快 10d 可出实验结果。

5. 本方案不适用大批量酵母双杂交实验，因为诱饵蛋白表达、自激活检测和毒性验证应该预先完成。

产品说明：

酵母双杂的原理基础：很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构城，即DNA 特异结合域（DNA-binding domainBD）与转录激活域（Transcriptional activationdomain，AD）。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域，否则无法完成激活功能。不同来源激活因子的 BD 区与 AD 结合后则特异地激活被 BD 结合的基因表达。基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白问能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使 AD 与 BD 形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白系统。分子间是否发生了相互作用。

酵母双杂交系统由三个部分组成：

(1) 与 BD 融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白（bait）。

(2) 与 AD 融合的蛋自表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋自（prey）。

(3) 带右一个或多个报告基因的宿主菌株。常用的报告基因有 HIS3，URA3，LacZ 和 ADE2 等。而菌株则具有相应的缺陷型。双杂交质粒上分别有不同的抗性基因和营养标记基因。这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。根据目前通用的系统中 BD 来源的不同主要分为 GAL.4 系统和 LexA 系统，目前常用的是 Y2HGold-GAL4 和 AH109-GAL4 系统。Y2HGold 菌株是 GAL4 系统酵母双杂实验用菌株，MATa 型，可直接转化质粒或与 MATa 型酵母菌株 Y187 通过 mating 操作进行蛋白互作验证或筛库试验。Transformation marker 为；trpl，lcu2，报告基因为：AbAr, HIS3，ADE2，MEL1.Y2HGold-GAL4 酵母双杂系统需要两种质粒配套使用：pGBKT7和 pGADT7 质粒 pGBKT7 的筛选标志为 TRP1，用于表达 DNA-BD(来自酵母转录因子 GAL4N 端 1~174位氨基酸)与目标蛋白（Bait）的融合蛋白；质粒 pGADT7 的筛选标志为 LEU，用于表达 AD（GAL4 C端 768~881 位氨基酸）与目标蛋白（Prey）的融合蛋白。

Y2HGold-GAL4系统酵母双杂互作验证试剂盒

一、实验耗材和试剂

本试剂盒提供的产品以产品组成为准，部分试剂和耗材需要自备，也可以在本公司单独购买。

1. 灭菌的枪头（1000uL、200uL、10uL）、涂布棒或玻璃珠，Φ90 mm 培养皿，备用。

2. Carrier DNA 在 95-100℃水浴 5 min，后快速冰浴，可再重复一次，备用。

3. 稀释金担子素：取 100uL AbA（1mg/mL）于 900μL 甲醇中稀释，充分混匀，即 AbA 浓度为 100ug/mL，4℃冰箱中备用（稀释 10 倍后使用有利于在培养基中混匀，建议按用量稀释）；

4. 普通平板制备：

将 1 条培养基倒入 0.5L 去离子水中，无需调节 pH 值，高压火（如 121℃灭菌 15min）。液体培养基 4℃保存备用；固体培养基，按照 20-25 mL/块倒平板（Φ90mm），凝固后放入 4℃冰箱保存；

5.特殊平板制备：

SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp with Agar（X-a-gal）：将一袋 SD/-Ade/-His/-Ieu/-Trp with Agar 培养基溶于 500mL去离子水，无需调节 pH 值，高压灭菌（如 121℃灭菌 15min），冷却 50℃左右，每 25 mL 固体培养基加入 25-50 uL X-a-gal 母液，倒平板（25 mL/块，Ф90 mm），凝固后于 4℃冰箱保存。

SD/-Ade/-His/-Leu-Trp with Agar(AbA+X-a-gal)：将一袋 SD/-Ade/-Hlis/-Leu/-Trp with Agar 培养基溶于500mL，去离子水，无需调节 pH 值，高压灭菌（如 121℃灭菌 15 min），冷却至 50℃左右，每 20 mL固体培养基加入 20-40 uL X-a-gal 溶液（20mg/mL），稀释后的金担子素（AbA）参考表 1 加入，倒平板 20mL/块（Φ90mm），凝固后于 4℃冰箱保存。

Y2HGold-GAL4系统酵母双杂互作验证试剂盒

二、实验方法

双杂实验方案较多，本公司根据多年经验，给出一个较优的点板互作验证实验方案，我们将蛋白表达，自激活检测，行性验证放在互作检测之后（本方案不作分析）。我们但设载体构建已完成，互作验证分为三个步骤；共转化，阳性克隆鉴定（选做），互作检测。本方案还对常见互作验证结果进行了分析。

2.1 共转化

1. 取 100uL 冰上融化的 Y2HGold 感受态细胞(货号：PG1029)，依次加入预冷的质粒 pGBKT7（2-5μg， 约5μL），pGADT7（2-5μg，约 5μL），Carrier DNA 5uL（95-100℃，5min，快速冰浴，重复一次），PEG/LiAc500uL 并吸打几次混匀，30℃水浴 30 min（15 min 时翻转 6-8 次混匀）。

2. 将管放 42℃水浴 15min (7.5 min 时翻转 6-8 次混匀)。

3. 5000rpm 离心 40s 弃上清，ddHO400uL 重悬，离心 30s 弃上清。

4. ddH2O 50uL 重悬，涂布于 SD/-Lcu/-Trp 平板，28-30℃培养 48-96 h。

注：按表 1，将各质粒转入酵母 Y2HGold 感受态细胞中。

注：对照组 1*和 2*可以更好的体现实验组是否有互作。

2.2 阳性克隆鉴定（选做）

此步骤可以省略。详细步骤可参考 PY1057-1ml-AD 2×Yeast direct PCR Mix（for pGADT7）、PY1057-1ml-BD 2×Yeast direct PCR Mix（for pGBKT7），本试剂盒分别包含猎物 AD、诱饵 BD 引物，可直接使用。

1. 每个样品挑取新鲜单克隆（2-3mm）于 1mL ddH2O 无菌水中重悬，OD600 调至 0.2（也可以用 SD/-Leu/-Trp液体培养基培养至 OD600-0.2）。

2. 用 ddH2O 依次稀释 10 倍，100 倍，1000 倍（即 OD600-0.2、0.02、0.002、0.0002）。

3. 按照先实验组后对照组的顺序，分别点 10μL 菌悬液于 SD/-Leu/-Trp、SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-a-gal平板（如已知自激活浓度，需加入 AbA），28-30℃培养 3-5 d。

• 互作验证分析
  3.1 互作/无互作
  由图 2 可知，对照组 Y2HGold[pGBKT7-53&pGADT7-T]和 Y2HGold[pGBKT7-Lam&pGADT7-T]在SD-Leu/Trp 板上长势相同:Y2HGold[pGBKT7-53&pGADT7-T]在 SD/Leu/-Trp/-His/-Ade/X-a-gal 板上显蓝色，且长势同 SD/-Leu/-Trp 板;而 Y2HGoldpGBKT7-Lam&pGADT7-T]在 SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-a-gal板上不生长且不显色，所以，pGBKT7-53 与 pGADT7-T 有互作，pGBKT7-Lam 与 pGADT7-T 无互作。同理，pGBKT7-Baitl 与 pGADT7-Prey1 有互作，pGBKT7-Baitl 与 pGADT7 无互作（即 pGBKT7-Bait1无自激活）。
  3.2 Bait 蛋白有自激活
  Y2HGold[pGBKT7-Bait2&pGADT7-Prey2]和Y2HGold[pGBKT7-Bait2&pGADT7]，在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-a-gal 板上显蓝色，且长势同 SD/-Leu/-Trp 平板，所以 pGBKT7-Bait2 具有自激活。解决自激活：在 SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-a-gal 板中加入梯度浓度的（AbA 和/或 3-AT），重做互作验证实验即可。
• 3.3 Prey 蛋白有毒性
  在 SD/-Leu/-Trp 平板上 Y2HGold[pGBKT7-Bait3&pGADT7-Prey3]长势明显弱于Y2HGoldpGBKT7-Bait3&pGADT7]但是在 SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-a-gal 板上 Y2HGold
  pGBKT7-Bait3&pGADT7-Prey3 能够显蓝色（虽然长势的），Y2HGold pGBKT7Bait3&pGADT7 不能生长或生长较弱，同样能够证明 pGBKT7-Bait3 与 pGADT7-Prey3 有互作，pGBKT7-Bait3 与 pGADT7无互作（即 pGBKT7-Bait3 无自激活）。
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四、注意事项

载体注意事项：

1. 建议收到质粒后请先转化感受态（克隆菌株），再挑选单菌落重新提取后使用。

2. 转化前请准确查找该质粒对应的抗生素、抗生素浓度、感受态（克隆菌株）和培养温度。

3. 如有必要请测序后使用，我司网站检索对应货号可下载质粒图谱。

培养基注意事项：

1. 华 越洋酵母缺陷培养基 pH 值已调节至 5.8，可直接使用。

2. SD 培养基可能溶解不彻底或灭菌后有少量沉淀，不影响实验进行。

3. SD 培养基灭菌后，颜色为白色至浅黄色。

感受态注意事项：

1. 一支感受态不建议分成两份使用。

2. 如果转化效率低，只有几个单克隆，建议做 PCR 鉴定。

3. 筛选出来的单克隆，一般是圆形凸起、边缘整齐、表面光滑湿润、不透明、乳白色-浅黄-浅粉色的菌落，有酵母气味。

本试剂盒注意事项：

1. 本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗，食品及化妆品等用途。

2. 为了您的安全和健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。

3. 请注意无菌操作，避免微生物污染。

4. 此方案仅供参考