Y1HGold-pAbAi 系统酵母单杂互作验证试剂盒

Y1HGold-pAbAi 系统酵母单杂互作验证试剂盒

Hyyp870

请按产品包装要求储存，有效期 1 年

类别	产品名称	规格	保存
培养基	SD/-Leu Broth	0.5L	常温储存
	SD/-Ura Broth	0.5L
	YPDA Medium	0.5L
	SD/-Leu with Agar	2×0.5L
	SD/-Ura with Agar	0.5L
筛选剂	金担子素A(AbA,1mg/mL)	lmg	-20℃储存
鉴定试剂盒	2×Yeast direct PCR Mix(不含引物)	2×1ml
转化试剂盒	酿酒酵母感受态制备及转化试剂盒	200T
质粒	pAbAi质粒	10μl
	p53-AbAi质粒	10μl
	pGADT7-p53质粒	10μl
	pGA DT7质粒	10μl
感受态细胞	Y1HGold感受态细胞	20×100ul	-80℃储存

注：

1. 本试剂盒可用于 10 对单杂互作验证(质粒除外)。

2. 注意每个成份的保存温度，感受态细胞务必-80℃保存。

3. 2×0.5L 表示：2 个包装，每个包装 0.5L；

4. 对照菌株的最佳 AbA 浓度参考网站菌株说明书。

产品说明:

YIHGold-GAL4-AbA 酵母单杂系统使用的菌株 YIHGold 是 MATa 型，可直接转化质粒进行筛库试验。筛选标记住为： ura3，leu2；报告基因为：AbAr。YIHGold-GAL4-AbA 母单杂系统需要 pAbAi 和 pGADT7两种质粒配套使用。质粒 pAbAi 的筛选标志为 URA 用于表达 pBait-AbAiconstruct(1~3 个 bait DNA 序列复串联后克隆到 pAbAi 中)；质粒 pGADT7 的筛选标志为 LEU，用于表达 AD(GAL4 C 端 768-881 位氨基酸)与目标蛋白(Prev)的融合蛋白。

GALA-AbA 酵母单杂系统原理：AureobasidinA(AbA)是一种环酯肽抗生素，在低浓度(0.1-0.2ug/mL)下即可对酵母产生毒性。基因组中整合了 pBait-AbAi 的酵母菌株(Bait-Reporter Yeast Strains)，当猎物蛋白(Prev)结合到诱饵序列(Bait DNA)上，GAL4AD 就会激活 AbAr 的表达，从而能够在含有抗生素 AbA 的培养基上生长。AbAr 与营养缺陷报告基因相比具有更低背量的优点，可以降低酵母单杂假阳性发生的概率。

本方案中筛选透饵酵母菌株的 AbA 最佳使用浓度和互作验证都采用了稀释点板的方法，与涂板的方法相比，点板法能更直观的体现出 DNA 和蛋白的互作，还能减少培养基和 AbA 的使用量。本方案中诱。饵菌株鉴定采用了高保真酶，大大减少了操作步骤，另外本方案还对常见的酵母单杂结果进行了分析.

 

一、实验耗材和试剂

本试剂盒提供的产品以产品组成为准，部分试剂和耗材需要自备，也可以在本公司单独购买。

1. 灭菌的枪头(1000μL、200 uL、10uL)、涂布棒或玻璃珠，Φ90 mm 培养皿，备用。

2. Carrier DNA 在 95-100℃水浴 5 min，后快速冰浴，可再重复一次，备用。

3. 稀释金担子素：取 100ul AbA(1mg/mL)于 900uL 无水乙醇中稀释，充分混匀,即 AbA 浓度为 100ug/mL，4℃冰箱中备用(稀释 10 倍后使用，有利于在培养基中混匀，建议按用量稀释)。

4. 自备 0.9%生理盐水，可用 ddH2O 无菌水代替，备用。

5. 普通平板制备

将 1 条培养基溶于 0.5L 去离子水中，无需调节 pH 值，高压灭菌(如 115℃菌 20min)。液体培养基 4℃冰箱保存；固体培养基，20-25 mL/块倒平板(Ф90 mm)，凝固后 4℃冰箱保存。

6. 特殊平板制备SD/-Leu(AbA)或 SD/-Ura(AbA)：将一条 SD/-Leu with Agar 培养基溶于 500mL 去离子水中，无需调节pH 值，高压灭菌(如 115℃灭菌 20min)，冷却至 50℃左右，参照表 1 加入稀释后的金担子素(AbA)，倒平板 20 mL/块(Φ90mm)，凝固后于 4℃冰箱保存。

表 1.                                               不同 AbA 浓度的平板

培养基体积(mL)                      20    20   20   20   20     20    20

AbA(100 μg/mL)加入量        0     20     40    60    100   140  200

AbA 终浓度(ng/mL)                 0     100   200    300  500   700  1000

 

二、实验方法

Y1HGold 酵母杂交互作验证实验方案较多，本公司根据多年经验，给出一个较优方案，略过载体构建，可为四个步骤：pBait-AbAi 转化 Y1Hgold，筛选诱饵酵母床株的 AbA 最佳使用浓度，Y1HGold[Bait]感受态制备与 Prey 转化，互作验证。此外，本方案还对常见的互作验证结果进行了分析。

2.1 pBait-AbAi 转化 Y1HGold

pAbAi 质粒是通过同源重组的方式整合到酵母染色体组中而存在于酵母体内的，所以转化之前要通过酶切的方法将环状的质粒线性化。将线性化的 pAbAi 质粒转入酵母 Y1HGold 菌株中，转化后的重组子(诱饵 AbA 特异性报告菌株)可以在 SD/-Ura 培养基上生长。

2.1.1 pBait-AbAi 质粒线性化

pBait-AbAi、p53-AbAi 和 pMutant-AbAi 测序后，将其大肠杆菌菌液进行扩大培养，然后提取质粒。

用 Bstb I 限制性内切酶(NEB)进行线性化处理。

诱饵载体酶切体系

组分                   体积

BstBI                      2uL

质粒 DNA    5-10ug

10×Buffer           5 uL

无酶 ddH20  补充至 50uL

65℃酶切 5 h，1%的惊脂糖跑胶，检测载休是否酶切完全。

2.1.2 pBait-AbAi 转化 Y1HGold

1. 取 100μl 冰上融化的 Y1HGold 感受态细胞(货号：PG1028)，依次加入 10ul 预冷的线性化质粒(线性化载体无需切胶回收)，Carrier DNA 10uL (95-100℃，5 min，快速冰浴，重复一次)，PEG/LiAc 500uL，轻柔混匀。30℃水浴 30 min (15 min 时翻转 6-8 次混匀)。

2. 将管放 42℃水浴 15 min (7.5 min 时翻转 6-8 次混匀)。

3. 5000 rpm 离心 40s 弃上清，ddH2O 400uL 重悬，离心 30s 弃上清。

4. ddH2O 50uL 重悬，涂板 SD-/Ura 平板，30℃培养 3-5 d。

2.1.3 诱饵菌株鉴定

试剂 50μl                                                   反应体系

2×Yeast direct PCR Mix                              25 μl

Y1H 引物混合物(或其它上下游引物)   (各 1μl)2μl

 

1准备 PCR 预混液：根据检测克隆数，等比例扩大配制体积。

2. 吸取 5ul 酵母快速裂解液加入 PCR 管中。

3. 用无菌牙签或 10 ul 枪头刮取筛选出来 SD/-Ura 固体培养基上的单菌落(直径 1-2 mm 刮取 1/4 即可)

悬浮在裂解液中。

4. 吹打或者震荡混匀后使用 PCR 仪 98℃裂解 5 min，即为裂解产物，

5. 在裂解产物中加入 45ul PCR 预混液(含引物)，PCR 扩增，PCR 反应条件：

 

95℃ 5 min

95℃ 45s

56℃ 30s   28cycles

72℃ 1kb/min

step 4℃  ∞

 

6. 将 PCR 产物于 1%琼脂糖凝胶电泳并测序验证。

注：a.本公司提供的酵母基因组菌落 PCR 试剂盒中 Y1HGold 引物混合物(未公开序列)扩增空载 pAbAi 重组Y1HGold 的产物为 1346 bp。测序可以用 pAbAiF(GCTCCTTCCTTCGTTCTTCCTTC)，或插入片段的特异性引物。

b. 用 1%的琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 扩增产物，鉴定阳性克隆，消除假阳性(PCR 分析结果应为：阳性对照 1.4 kb；阴性对照，无条带:诱饵菌株.1.35 kb+insert size)。

2.2 筛选诱饵酵母菌株的 AbA 最佳使用浓度

诱饵酵母菌株在没有 Prey 载体存在情况下，其基本 AbA 表达量非常低。对于不同的诱饵片段，其AbA*最佳使用浓度不同。因此，需要筛选每个诱饵醒母菌株的 AbA 最佳使用浓度，具体步骤如下

1. 上述的转化验证成功之后，每个样品挑取新鲜单菌落(2-3mm)于 1mL0.9%氯化钠溶液中重悬,OD600

调至 0.2(也可以用 SD-Ura 液体培养基培养至 OD600-0.2)

2. 用 0.9%氯化钠溶液依次稀释 10 倍，100 倍，1000 倍(即 OD00=0.2，0.02，0.002，0.0002)

3. 分别点板 10uL 于 SD/-Ura；SD/-Ura with AbA(100 ng/mL、200ng/mL、300ng/mL、500ng/mL、800 ng/mL

1000ng/mL)平板，如图 1 所示。

4. 30℃培养 2-3 d，观察诱饵酵母在不同 AbA 浓度平板上生长状况，从而确定 AbA 最佳使用浓度(例如，YIHGold p53-AbAi 诱饵菌株 OD600-0.002 时，在 SD/-Ura with AbA(200ng/mL)平板上刚好不能生长)。

注：在不同浓度 AbA 平板上(100 ng/mL，200ng/mL，300ng/mL，500ng/mL，700ng/mL，1000ng/mL)

出现的酵母菌斑最少或完全没有，即为 AbA 最佳使用浓度(最佳抑菌浓度、最小抑菌浓度、木底表达浓度、自激活浓度)。一般情况下 AbA 浓度不宜超过 1000ng/mL。

 

图 1 点板筛选 AbA 最佳使用浓度的示意图

2.3 Y1HGold pBait]感受态制备与 Prey 转化

1. 挑取鉴定成功的 Y1HGoldnBait-AbAi 单菌落干 SD-Ura 培养基平板上划线，30℃培养 3-5 d。

2. 待酵母单菌落直径长至 2-3 mm，挑取单菌落接种到含有 3mL YPDA 液体培养基的 15 mL 摇菌管中。30℃，200 rpm 过夜培养。

3. 将 3mL 小摇菌体(上步小摇所得)接到含有 50mL 液体 YPDA 培养基的三角瓶中继续培养，待 OD600 达到 0.4-0.5，3000rpm 离心 5 min，弃上清。(4℃保存 1 周内的酵母菌液，用 3mL 接种 50 mL YPDA 培养基过夜培养)。

4. 用 10ml 无菌的去离子水悬浮沉淀，3000rpm 离心 5min，弃上清。

5. 加入 1ml TE/LiAC 酵母感受态制备液重悬，100 ul 分装于 1.5 ml 无菌离心管，可直接用于转化。

6. 取上述 Y1HGold[pBait-AbAi 感受态细胞 50μL 于冰上，依次加入预冷的目的质粒 1ug，PEG/LiAc 酵母转化液 500uL，轻柔混匀，30℃水浴 30min (10 min 时转 1 次混匀），42℃水浴 15min (7.5 min 时转 1次混匀）。实验组和对照组的设置参考表 1。

7. 4000rpm 离心 5min，弃上清。

8. 用 1ml YPD Plus Medium 重悬沉淀，30℃摇床震荡培养 60min，12000rpm 离心 15s，去掉上清。

9. 加入 50uL ddHO 重最菌体，涂板 SD-Leu 平板，30℃培养 3-5d。

2.4 互作验证

1. 上述的转化成功之后，每个样品排取新鲜单菌落(2.3mm)于 1mL0.9%氯化钠溶液中重县，OD 调至 0.2(也可以用 SD-Leu 液休培养基培养至 OD0.2)。

2. 再用 0.9%氧化钠溶液依次稀释 10 倍，100 倍，1000 倍(即 OD600 值 0.2，0.02，0.002，0.0002)

3. 按照先实验组后对照组的顺序，分别点板 10 uL 于相应的 SD/Leu with AbA*平板，参考图 1。

4. 30℃培养 2-3d，观察每组重组酵母在对应的自激活 AbA 浓度平板上生长状况，从而确定是否互作。

三、互作验证分析

3.1 互作

由诱饵酵母菌株的 AbA 最佳使用浓度筛选可知 Y1HGold[p53-AbAi]自激活浓度是 200ng/mL 由图 2可知，在 SD/-Leu 平板上，对照组 Y1HGoldp53-AbAi&pGADT7-p53]和 Y1HGold[p53-AbAi&pGADT7]长势相同。在 SD/-Leu with AbA(200ng/mL)平板上，Y1HGold[p53-AbAi&pGADT7-p53]长势明显优于Y1HGold[p53-AbAi+pGADT7]，所以 p53-AbAi 与 pGADT7-p53 具有互作。同理，Bait1 和 Prey1 也有互作。

注：AD-p53 与 p53 结合序列(顺式作用件)的相互作用而诱发 AbA 抗性基因 AURI-C 的表达，所以 Y1HGold[p53-AbAi+pGADT7-p53]能够在 SD/-Leu with AbA(1000ng/mL)平板上生长。

3.2 Prey 蛋白有毒性

由诱饵酵母菌株的 AbA 最佳使用浓度筛选可知 Y1HGold[pBait2-AbAi 自激活浓度是 100ng/mL。由图2 可 知 ， 在 SD-Leu 平 板 上 ， YIHGoldBait2-AbAi+pGAD17-Prev2 长 势 强 于 对 照 组YIHGold[pBait2-AbAi+pGADT7]，可能是 Prey 蛋白有毒性导致;但是在 SD/-Leu with AbA(100ng/mL)和SD/-Leu with AbA (300ng/mL) 平 板 上 ， Y1HGoldpBait2-AbAi+pGADT7-Prey2] 长 势 优 于Y1HGold[pBait2-AbAi+pGADT7]，所以 Bait2 与 prey2 有互作。

注：酵母杂交互作验证实验，不适于毒性很强的 Prey 蛋白。

3.3 无互作由图 2 可知，在所有的 SD 平板上，

YIHGold pBait3-AbAi&pGADT7-Prey3/Y1HGoldpBait3-AbAi&pGAD17

Y1HGoldpBait4-AbAi&pGADT7-Prey4/Y1HGold[pBait4-AbAi&pGAD17]长势都相同，所以 Bait3 与 prey3，Bait4 与 prey4 均无互作。

注：YIHGold[pBait3-AbAitpGADT7 仅在 SD/-Leu 平板上生长，说明 Bait3 无自激活。

YIHGoldpBait5-AbAi+pGADT7]能够在 SD/-Leu with AbA(300ng/mL)平板上长势相同，说明 Bait5 具有一定的自激活。