酵母己糖转运活性检测试剂盒

                                                       酵母己糖转运活性检测试剂盒

hyyp98-20T 4750

储存条件: 请按产品包装要求储存，有效期一年。

产品组分:

酵母己糖转运活性检测试剂盒

产品说明:

1. 感受态细胞请-80℃储存，干冰运输。

2. 培养基系列的产品，请在500mL的蒸馏水中，加入一包干粉搅拌混匀后，于121℃灭菌15min 后使用。

产品简介:

      EBY.VW4000 酿酒酵母菌株是己糖转运缺陷型菌株，多用于己糖转运蛋白的鉴定试验。其缺失了全部 己糖转运蛋白，丧失了吸收转运己糖的能力。该菌株在含有麦芽糖的培养基上可以正常生长，在己糖为唯 一碳源的培养基上基本不生长。

pDR196 是酿酒酵母蛋白高效表达载体，筛选标记为Ura3。将己糖转运蛋白Xgene构建到pDR196载体中(pDR196-Xgene)，将其转化EBY.VW4000感受态细胞，Xgene蛋白就会促进酵母吸收利用培养基中的 己糖，进而使得EBY.VW4000酵母菌能够在含己糖培养基中正常生长

酵母己糖转运活性检测试剂盒

产品特点:

本试剂盒可用于检测蛋白是否具有己糖转运活性，简单高效。包含了己糖转运活性检测所需的全部试 剂、菌株和载体。

 注意事项:

1. 请注意无菌操作，避免微生物污染。
2. 本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗、食品及化妆品等用途。
3. 为了您的安全的健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。

操作步骤：

• 培养基准备

SD/-Ura with Agar(含葡萄糖)固体培养基：

将1袋培养基溶于0.5L去离子水中，无需调节pH值，高温高压灭菌(如115℃灭菌20min)。按照20-25mL/块倒平板(90mm)，凝固后4℃冰箱保存。

SF/-Ura with Agar(含果糖)固体培养基： 

将1袋培养基溶于0.5L去离子水中，无需调节pH值，高温高压灭菌(如115℃灭菌20min)。按照20-25mL/块倒平板(90mm)，凝固后4℃冰箱保存。 

SM/-Ura with Agar(含麦芽糖)固体培养基： 

将1袋培养基溶于0.5L去离子水中，无需调节pH值，高温高压灭菌(如115℃灭菌20min)。按照 20-25mL/块倒平板(90mm)，凝固后4℃冰箱保存。 

SM/-Ura Broth(含麦芽糖)液体培养基： 

将1袋培养基溶于0.5L去离子水中，无需调节pH值，高温高压灭菌(如115℃灭菌20min)。用于摇菌使用，冷却后4℃冰箱保存。

• 实验流程 
  1. 载体构建

将待验证Xgene的CDS 构建到pDR196载体中，即为实验组pDR196-Xgene。

pDR196载体克隆检测引物:

pDR196-F：GATGTTAGACGATAATGATAGGAC

pDR196-R：ACCTGACCTACAGGAAAGAG

1. 2. 酵母转化
1. 将Carrier DNA 于 95-100℃水中煮5min,立即置于冰上2min，重复一次，置于冰上备用。
2. 取100uL的EBY.VW4000感受态细胞冰上融化，依次加入预冷的目的质粒1-3ug，CarrierDNA 5uL，PEG/LiAc 500uL，轻轻翻转混匀6-8次；

3.30℃水浴30min，每15min轻轻翻转混匀6-8次；

4.42℃水浴15min，每7.5min轻轻翻转混匀6-8次；

5. 10,000 rpm 离心 30s弃上清；

6. 加入100uLddH2O重悬，涂布SM/-UrawithAgar平板。28-30℃培养2-3d。按下表，将各质粒分别转化酵母EBY.VW4000感受态细胞。

酵母转化反应

3 阳性克隆鉴定(选做)

此步骤可以忽略，详细步骤可参考酵母直扩酶2×Yeast direct PCR Mix，鉴定引物可以用pDR196-F与pDR196-R，实际扩增条带为408 bp+目的片段大小。

3.4已糖转运活性检测

1. 在每个平板中挑取新鲜单菌落，用SM/-UraBroth(含麦芽糖)液体培养基过夜培养，OD600为1-2之间。
2. 6000g离心 1min，弃上清。用灭菌ddH2O洗涤三次，并稀释至OD600为1。
3. 用 ddH2O 依次稀释10倍，100倍，1000倍(即OD600=1，0.1，0.01，0.001)。  
4. 按照先后顺序，分别取5uL 点板含不同糖平板(SM/-Ura、SD/-Ura、SF/-Ura)。
5. 28-30℃培养 2-3d，观察每个样品在不同筛选平板上的生长状况，确定目标蛋白是否具有糖转运活性。

酵母己糖转运活性检测试剂盒

3.5 示例结果分析

将阳性对照、阴性对照以及实验组载体分别转化EBY.VW4000感受态细胞。

结果分析：

EBY.VW4000[pDR196-SWEET14]（阳性对照）、

EBY.VW4000[pDR196]（阴性对照）、

EBY.VW4000[pDR196-Xgene]（实验组）、

在SM/-Ura(含麦芽糖)培养基均能够正常生长；

在SD/-Ura(含葡萄糖)培养基、SF/-Ura(含果糖)培养基中，同浓度梯度的阳性对照的生长应明显强于阴 性对照，因为SWEET14具有己糖转运活性，SWEET14的表达促进了酵母吸收利用葡萄糖和果糖（如图）。

      若实验组Xgene的生长明显强于阴性对照，则说明Xgene的表达促进了酵母吸收利用葡萄糖和果糖， 即Xgene具有己糖转运活性。反之Xgene则不具有己糖转运活性。