酵母基因组DNA快速提取试剂盒

Yeast genomic DNA Kit

酵母基因组DNA快速提取试剂盒

HYYAB90-50t

5. 适用范围：

适用于酵母基因组DNA提取。

5. 试剂盒组成、储存、稳定性：

本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。

储存事项:

1. 结合液CB或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀，可以在37°C水浴几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
2. 蛋白酶K保存在即用型甘油缓冲液中，常温运输。收到后，不超过25°C室温至少保存6个月，4°C保存12个月，-20°C保存2年。
3. Lytic Enzyme为蜗牛酶甘油储液，因此比较粘稠，请小心取用，-20°C保存。 蜗牛酶是从蜗牛的嗦囊和消化道中制备的混合酶，它含有纤维素酶，果胶酶，淀粉酶，蛋白酶等20多种酶。适合破碎溶解各种酵母的细胞壁。
4. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

5. 产品介绍：

本试剂盒采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，用于提取酵母细胞中的基因组DNA。无需酚氯仿等有毒试剂，也无需进行耗时的醇类沉淀，最大限度的去除蛋白及其他抑制性杂质。提取的DNA可直接用于酶切、PCR、Southern Blot等实验。

5. 产品特点：

1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2. 快速，简捷，单个样品裂解后操作一般可在30 min内完成。
3. 多次柱漂洗确保高纯度，OD₂₆₀/OD₂₈₀典型的比值达1.7～1.9，可直接用于PCR，Southern-blot和各种酶切反应。

5. 关于平衡液的使用

1. 介绍：核酸吸附硅胶膜柱子长期放置过程中会同空气中的电荷/尘埃发生反应而影响其核酸的结合能力。硅胶柱经平衡液预处理后可大大减少柱子中硅胶膜的憎水基团，提高核酸的结合能力。从而提高硅胶柱子回收效率或者产量。平衡液是强碱性溶液，若不小心碰到，请用大量自来水清洗。用完后需盖紧瓶盖，以免接触空气。室温保存。在保存过程中可能有沉淀生成，请加热至37°C使沉淀完全消失。
2. 使用方法：取一个新的硅胶膜吸附柱子装在收集管中，吸取100 μl的平衡液至柱子中。13,000 rpm离心1 min，倒掉收集管中废液，将吸附柱子重新放回收集管。此时平衡液预处理柱子完毕。接后续的操作步骤。  

5. 注意事项

1. 需要自备乙醇、异丙醇、 β-巯基乙醇。
2. 结合液CB 和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
3. 菌体浓度检测一般OD600值为1的时候,酿酒酵母细胞是1-2×10⁷ cells/ml，由于菌种和分光度计不同即使同样细胞数量OD值变化也很大，以上仅供参考。

5. 操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）
   • 第一次使用前请先在漂洗液WB瓶中按照标签指示加入无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
   • 吸取使用量的缓冲液SE加入0.2% β-巯基乙醇，备用。

1. 取1-3 ml酵母培养物(不超过3×10⁷ cells，最好是早对数生长期)，13,000 rpm离心30 sec，尽可能的吸弃上清，收集菌体。

▲收集超过1.5 ml菌液，可以离心弃上清后，在同一个1.5 ml管内加入更多的菌液，重复步骤1，直到收集到足够的菌体。

2. 加入300 μl 缓冲液SE，轻柔吹打充分重悬细胞；再加入50 μl Lytic Enzyme储液，充分颠倒混匀，37°C温育1-3 小时消化细胞壁，中间可颠倒数次帮助消化。

▲如果破壁效果不好导致产量低，可以加大lytic Enzyme 用量来提高酶工作浓度，还可以延长消化时间或者提高温度到45°C来提高效果，不适合Lytic Enzyme消化的酵母可选用其它酶（Lyticase）消化或者0.5 mm玻璃珠涡旋击打 ，反复冻融等。玻璃珠法：向菌体中加入180 μl 缓冲液YB彻底悬浮菌体，加入0.1g直径为0.45-0.55 mm的酸洗玻璃珠，涡旋振荡10 min，静置几分钟让玻璃珠沉淀，小心吸取上清到一个新管后接后续步骤4。

3. 13,000 rpm离心1 min，尽可能吸弃上清，加180 μl 缓冲液YB充分重悬细胞团。
4. 加入20 μl的蛋白酶K溶液，立刻涡旋振荡充分混匀。
5. 将混合物放置在55°C水浴消化直到消化完全，期间轻柔的振荡几次帮助裂解。

▲所需消化时间和酵母数量、种类和生长状态有关，一般15 min即可，但是如果方便的话消化过夜也无不良影响。

▲可选步骤，一般不需要: 如果RNA残留较多，需要去除RNA，可在完成操作步骤5后加20 μl RNase A(10mg/ml)溶液，振荡混匀，室温放置5-10 min。

6. 加入200 μl结合液CB，立刻涡旋振荡充分混匀，70°C放置10 min。

平衡液预处理吸附柱备用：

使用平衡液预处理硅胶膜吸附柱为必做步骤，具体方法参见前文“关于平衡液的使用” 

7. 冷却后加入100 μl 异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。将混合物（包括可能有的沉淀）加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm离心30 sec，倒掉收集管中的废液。

▲上述步骤中立刻涡旋或者吹打充分混匀非常重要，混匀不充分严重降低产量，必要时如样品粘稠不易混匀时可以涡旋振荡15 sec 混匀。

8. 加入500 μl抑制物去除液IR，13, 000 rpm 离心30 sec，弃废液。
9. 加入600 μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），13, 000 rpm 离心30 sec，弃废液。

加入600 μl漂洗液WB重复步骤9一遍。

10. 将吸附柱AC放回空收集管中，13, 000 rpm 离心2 min，尽量除去漂洗液， 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
11. 取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50-100 μl洗脱缓冲液EB （洗脱缓冲液事先在80-100°C水浴中预热可以提高产量）， 室温放置3-5 min，13, 000 rpm 离心1 min。

▲可将第一次洗脱所得溶液重新加入离心柱中，室温放置2 min，13, 000 rpm离心1 min。可以提高浓度10%左右。

▲洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积不应少于30 μl，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。

12. DNA可以存放在-20°C，如果要长时间存放，可以放置在-70°C。