柑橘原生质体制备与转化试剂盒（20 mL/T）

柑橘原生质体制备与转化试剂盒（20 mL/T）

货号：hyypc1211-5T     1698元

产品内容：

运输及储存条件：本试剂为干冰运输；试剂避光保存于-20℃; 有效期 18 个月。

产品介绍：

试剂盒主要通过纤维素酶和离析酶消化植物细胞壁获得原生质体。适用于从 30 d 的柑橘幼苗中分离原生质 体。获得的原生质体可用于蛋白的亚细胞定位，验证蛋白间的相互作用，转录因子的转录调控等。本试剂 盒包含原生质体制备和转化需要的全部试剂，按照每次 20 mL 酶解液的使用量，可供 5 次原生质体制备以 及 120 个转化反应。

产品特点：

本试剂盒包含原生质体制备和转化需要的全部试剂，按照每次 20 mL 酶解液的使用量，可供 5 次原生质体 制备以及 120 个转化反应。

注意事项：

1.  分离制备的原生质体没有细胞壁的保护，非常脆弱，整个实验操作过程中动作尽可能轻柔。

2.  为了避免原生质体离心时贴在管壁，建议整个实验过程使用水平转子。

3.  实验过程中尽可能使用切过尖的 1 mL 蓝枪头，保证平滑，可避免原生质体破裂。

4.  若无水平转子，可适当调整离心力、离心时间、升降速，以保证实验成功。

5.  转化时建议添加空载荧光对照，以验证操作步骤无问题。

6.  土培的成株期植株的组织分离效果会偏差，属于正常现象。

操作步骤：（在开始操作前请先阅读注意事项）

一、准备工作

1.  需要自行准备的材料

锋利刀片；血球计数板；50 mL 离心管；2 mL 离心管，切过尖的灭菌蓝枪头和黄枪头、10 µL 白枪头(进口的更佳)。

2. 酶解液配制

注：

1.  酶解液必须现配现用。

2.  根据实验的需要选择酶解液是否需要过滤除菌。

3.  将培养液 CM 放在冰上预冷，便于后续使用。

二、原生质体的分离制备

1.  准备 30 d 的柑橘幼苗，建议使用无菌播种得到的柑橘幼苗，效果更佳。  注：若使用土培苗，最好用无菌 ddH2O 冲洗擦干后使用，减少细菌的繁殖。

2.  取 2-6 个柑橘叶片（样品量约 1-2 g，可适当增加），用刀片平行主叶脉，切成 0.5-1.0 mm 的细丝。

3.  将切好的细丝放入装有 20 mL 酶解液的50 mL 容积的小烧杯中，锡箔纸包裹，烧杯口留洞，抽真空 30 min（15 Hg/50 kpa/0.5）。

注：在原生质体制备与转化过程中，避光能够提高酶解效率和原生质体的稳定性。

4. 避光 28 ℃ , 40 rpm 摇床上孵育 5 h。收集原生质体前，80 rpm 摇动 5 min ，让原生质体完全释放出来。

5. 用 1 mL 培养液 CM 润洗细胞筛后，弃废液。

6. 将酶解后的产物用细胞筛过滤，用镊子或无菌枪头轻轻挤压酶解物帮助充分释放原生质体，此时肉眼 可见浓绿色液体滴落（挤压步骤十分重要）。用 5 mL 的培养液 CM 冲洗酶解器皿和未消化的叶片 2 次

（用切过尖的蓝枪头冲洗），将所有的液体收集到一个 50 mL 离心管中。

可选：也可以在第一次过滤后，小心将植物组织转移到锥形瓶中，加入 10 mL 的培养液 CM，在 28 ℃摇 床 80 rpm 摇动5 min，第二次过滤后，再用 5 mL 培养液 CM 冲洗酶解器皿和未消化的叶片 2 次。二次重 悬过滤可以一定程度提高原生质体的产率，增加转化数。

注：操作过程尽可能轻柔，避免剧烈震荡，过滤时可以将 50 mL 离心管倾斜 70°, 可以缓冲溶液下落时 产生的碰撞力，防止原生质体破碎。

7. 用切过尖的蓝枪头，取一滴酶解液进行镜检。若在 100×视野中可观察到圆形的原生质体，则可继续进 行实验。若视野内原生质体大量破碎或皱缩发黑，则弃去。

8. 选用水平转子，室温 150 g 离心5 min，升速 3，降速 3 ，去除上清（管中绿色沉淀即为原生质体）。

注：离心时，可调低离心机的升速和降速。升速过快，原生质体可能离到管壁上导致破碎；降速过快， 可能导致管底原生质体悬起。且过快的升降速会使原生质体破碎。建议升速和降速分别都使用 3。

9. 加入 10 mL 培养液 CM 温柔重悬位于底部的原生质体（切过尖的蓝枪头），150 g 离心3 min，升速 3， 降速 3，去上清。

10. 在离心前，可以显微镜下观察原生质体的状态和血球计数板计数。

血球计数板的使用：

如下图所示，在血球计数板上加上一个盖玻片，分别从两侧凹槽加入样品。使用中央区域长和宽都是 1    mm 的方形区域进行计数（25 个中方格）。分别统计正方形四个顶角和中央的小正方形的细胞数量，取平 均值再乘以 25（正方形被分成了 25 个小正方形），计算该区域的细胞数量，该区域的体积为 0.1 µL（长  1 mm，宽 1 mm，高 0.1 mm）。计算获得的细胞数量。原生质体浓度（个/mL）=25 个中方格原生质体数× 10⁴ ×稀释倍数。

11. 用相应体积的重悬液 RS 重悬原生质体，调整原生质体密度为 2×105/mL。（根据细胞数量和所需反应 数，加入对应的重悬液 RS 体积，100 µL/1 个反应）

三、原生质体的转化

1.  在 2 mL 的灭菌圆底离心管中加入 3-20 µg（总体积不超过 10 µL，根据实验需要用无菌 ddH2O 补齐） 纯化后的高质量质粒（建议去内毒素），随后加入 100 µL 调整好浓度的原生质体，轻弹充分混匀。

2.  加入 110 µL 的转化液 TP，轻弹混匀或切过尖的蓝枪头轻轻吸打混匀，过程中应避免产生气泡，室温孵 育 3-30 min（常规实验不超过 15 min）。

注：去内毒素质粒对转化效率有极明显提升（近 3 倍），建议购买去内毒素质粒大提试剂盒（吸附柱法）。转化液 TP 较难溶解，需 65 ℃水浴完全溶解后（约 10 min），冷却至室温后使用。原生质体与转化 液 TP 较难混匀，请耐心缓慢的吸打，以至充分混匀，保证转化效率。

3.  加入 500 µL 培养液 CM，轻柔颠倒混匀，终止转化。室温 150 g 离心 3 min，升速降速 3，在不损失原 生质体的情况下，尽可能去上清。

4.  加入 500 µL 培养液 CM 重悬原生质体，室温 150 g 离心3 min，升速 3，降速 3，去上清。

四、原生质体的培养和收集

1.  加入 600 µL 培养液 CM 培养悬浮细胞。将离心管水平室温避光放置，孵育 12-16 h。

2.  收集细胞时，缓慢拿起离心管，用枪头将附着在管壁上的细胞轻轻悬起，离心管室温垂直静置 3 min 后 再离心，室温 150 g 离心 3 min，升速 3，降速 3，去除大部分培养液 CM，收集原生质体，用于后续实验。