马铃薯原生质体制备及转化试剂盒

马铃薯原生质体制备及转化试剂盒

货号：hyypc1161-5T     2798元

产品内容：

运输及储存条件：

A 盒为蓝冰运输，B 盒为常温运输；收货后应将 A 盒避光保存于-20℃ , B 盒保存于2-8℃; 本试剂盒溶液 易污染，建议开封后立即使用；试剂盒组分未开封的有效期为 18 个月。

产品介绍：

本试剂盒主要通过酶的消化作用，酶解植物细胞壁获得原生质体。适用于从马铃薯叶片中分离和转化原生 质体。获得的原生质体可用于蛋白的亚细胞定位，验证蛋白间的相互作用，转录因子的转录调控等实验。

产品特点：

本试剂盒包含原生质体制备和转化需要的全部试剂，按照每次 20 mL 酶解液的使用量，可供 5 次原生质体 制备以及 120 个转化反应。

注意事项：

1.  分离制备的原生质体没有细胞壁的保护，非常脆弱，整个实验操作过程中动作尽可能轻柔。

2.  实验过程中尽可能使用切过尖的枪头，保证切口平滑，可减少原生质体破裂。

3.  若无水平转子，可适当调整离心力、离心时间、升降速，以保证实验成功。

4.  转化时建议添加空载荧光对照（例如 pBI221-EGFP）， 以验证操作步骤无问题。

5.  本试剂盒经过多次质检，可确保实验的稳定性。若实验员为首次实验，建议进行预实验以熟练操作流程。 在每步后进行镜检，观察原生质体状态， 以自检实验操作流程。

6.  请使用去内毒素质粒进行转化。

操作步骤：（在开始操作前请先阅读注意事项）

一、准备工作

1. 需要自行准备的材料

锋利刀片；血球计数板；50 mL 圆底离心管；2 mL 离心管，切过尖的灭菌蓝枪头和黄枪头，10 µL 白枪头。

2.酶解液配制

注：

1.  酶解液必须现配现用，根据实验的需要选择酶解液是否需要过滤除菌。

二、原生质体的分离制备

1.  准备马铃薯材料，取材以 30 d  内的幼嫩真叶为优。

2.  取 5-10 片（约 1 g）叶片，用锋利刀片平行主叶脉，切成 0.5-1.0 mm 的细条。

3.  将切好的细条放入装有 20 mL 酶解液的50 mL 容积的小烧杯中，锡箔纸包裹。

注：避光步骤可防止原生质体的光合作用，有氧呼吸释放的活性氧可能不利于原生质体生存。

4.  避光 28 ℃ , 45 rpm/min 摇床上孵育 4 h。

5.  用 1 mL 培养液 CM 润洗细胞筛。

6.  将酶解后的产物用细胞筛过滤，用镊子或无菌枪头尾部轻轻挤压酶解物帮助其充分释放原生质体，此时 肉眼可见浓绿色液体滴落（挤压步骤十分重要）。用 5 mL 培养液 CM 冲洗酶解器皿和未消化的叶片 2 次

（使用切过尖的蓝枪头冲洗），将所有液体收集至 50 mL 圆底离心管中。

注：操作过程尽可能轻柔，避免剧烈震荡，过滤时可以将 50 mL 离心管倾斜 70 ° , 缓冲溶液下落时产生的 碰撞力，防止原生质体破碎。

7.  用切尖枪头，取一滴酶解液进行镜检。若在 100×视野中可观察到圆形的原生质体，则可继续进行实验。 若视野内原生质体大量破碎或皱缩发黑，则弃去。

8.  选用水平转子，室温 800 rpm 离心 5 min ，升速 3 ，降速 3 ，去上清（管中绿色沉淀即为原生质体）。

注：离心时，可调低离心机的升速和降速。升速过快，原生质体可能离到管壁上导致破碎；降速过快，可 能导致管底原生质体悬起。

9.  向上述沉淀中加入 5 mL 培养液 CM 温柔重悬位于底部原生质体（切过尖的蓝枪头），备用。

10.  将 10 mL 分离液 MP 加入新的 50 mL 圆底离心管后，将第 9 步液体缓慢的放在分离液 MP 上。此时可 观察到上层为绿色原生质体，下层为无色分离液 MP。

11.  将上述液体室温 800 rpm 离心 5 min，升速 3 ，降速 3。缓慢拿取并吸取位于中间环带的原生质体，约 3 mL 于新的 50 mL 圆底离心管中。

12.  向上述液体中加入 5 mL 培养液 CM ，室温 800 rpm 离心 5 min ，升速 3 ，降速 3 ，去除上清。

注：在离心前，可以显微镜下观察原生质体的状态和血球计数板计数。

血球计数板的使用：

如下图所示，在血球计数板上盖玻片，分别从两侧凹槽加入样品。使用中央区域长和宽都是 1 mm 的方形 区域进行计数（25 个中方格）。分别统计正方形四个顶角和中央的小正方形的细胞数量，取平均值再乘以 25（正方形被分成了25 个小正方形），计算该区域的细胞数量，该区域的体积为 0. 1 µL（长 1 mm，宽 1 mm， 高 0. 1 mm ）。计算获得的细胞数量，原生质体浓度（个/mL）=25 个中方格原生质体数×10⁴ ×稀释倍数。

13.  在上述沉淀中加入 1 mL 培养液 CM ，用切尖蓝枪头转移至 2 mL  圆底离心管中。800 rpm 离心 3 min， 升速 3 ，降速 3 ，去上清，用相应体积的重悬液 RS 重悬原生质体，调整原生质体密度为2×105/mL 。（根 据细胞数量和所需反应数，加入对应的重悬液 RS 体积，100 µL/1 个反应）

三、原生质体的转化

1.  在 2 mL 灭菌圆底离心管中加入 5-20 µg（总体积不超过 10 µL）纯化后的高质量质粒（去内毒素），随 后加入 100 µL 上述重悬后的原生质体，轻弹混匀，42℃水浴 5 min。

2.  向上述溶液加入 110 µL 的转化液 TP ，颠倒混匀，室温避光孵育 15 min 。请注意严格控制孵育时间。

注：去内毒素质粒对转化效率有极明显提升（近 3 倍） ，建议购买 PE036  去内毒素质粒大提试剂盒（吸 附柱法）。原生质体与转化液 TP 较难混匀，请耐心缓慢操作，以至充分混匀，保证转化效率。

3.  加入 1 mL 培养液 CM ，轻柔颠倒混匀，终止转化。室温 800 rpm 离心 3 min ，升速 3 ，降速 3 ，在不损 失原生质体的情况下，尽可能去上清。

4.  加入 1 mL 培养液 CM 重悬原生质体，室温 800 rpm 离心 3 min ，升速降速 3 ，去上清。

四、原生质体的培养和收集

1.  加入 1 mL 培养液 CM 培养悬浮细胞，此时可取样镜检，观察原生质体状态。随后将离心管于室温水平 避光放置，孵育 12-16 h。

2.  收集细胞时，缓慢拿起离心管，用切尖枪头将附着在管壁上的细胞轻轻悬起，室温 800 rpm 离心 3 min， 升速 3 ，降速 3 ，去除大部分培养液 CM ，收集原生质体，用于后续实验。

可选：用 1 mL  酶解缓冲液 EC2 润洗细胞培养板后，将 1 mL 培养液 CM 加入细胞培养板备用。将 1 mL 培养液 CM 重悬原生质体，将其加入上述细胞培养板中，室温过夜培养。