植物转录活性检测试剂盒

植物转录活性检测试剂盒

货号：hyykb140-10ug    2998元

产品内容：

运输及储存条件：本试剂盒各组分蓝冰运输；-20℃保存。 

产品介绍

双荧光素酶（Dual-lucuferase，Dual-Luc）报告基因检测系统（植物转录活性检测系统）可以应用到植物蛋白转录活性的检测分析。在同一细胞内同时表达萤火虫荧光素酶（FLuc）和海肾荧光素酶（RLuc），两者分别可以催化荧光素和腔肠素发生氧化反应并产生荧光，通过荧光检测仪可以检测到荧光强度。RLuc作为内参基因可以减少细胞活性和转染效率等外在因素产生的实验误差。GAL4 BD为本底表达，GAL4 BD-VP16 可以作为转录激活活性的阳性对照。将待检测的转录因子与GAL4 BD或 GAL4 BD-VP16融合表达，BD结合5×GAL4-TATA 转录调控元件进而调控 FLuc的表达。通过 FLuc与 RLuc的比值，即可判断该转录因子具有转录激活活性或转录抑制活性[^1-6]。

产品特点

1. 本试剂盒提供了植物转录活性检测用到的 3个质粒，包含 1个Reporter质粒、2个Effector 质粒。

2. 提供了在植物原生质体中检测转录因子转录活性的方案。检测系统灵敏高效，应用范围广。

3. 优化了转录活性测定的经典实验体系。内参基因 RLUC 与报告基因 FLUC 整合于同一载体，内参控制更准确，操作更简便。

注意事项

1. 本产品提供了在植物系统内检测蛋白转录活性的实验方案，方案不唯一，可根据文献记录及自己实验的实际情况对相关内容进行调整。

2. 第一次使用本产品质粒时，请重新转化大肠杆菌克隆菌株（如 DH5α）扩繁，提取质粒后使用。

3. 实验方案中所涉及到的试剂产品均可在本司购买。

4. 本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗、食品及化妆品等用途。

实验方案：（在开始操作前请先阅读注意事项）

一、载体构建

（1）质粒基本信息

（2）实验组载体构建

在本方案中，我们提供了两种转录活性分析（Transcriptional activity analysis）载体构建方案。方案不唯一，用户应根据自己的实验设计及参考文献，选择合适的载体构建方案

方案一：

将需要研究转录活性的目的序列（X）构建到 pGreenⅡ 62-SK-BD 载体的 BD 结构域的下游 MCS 区，形成 pGreenⅡ 62-SK-BD-X 实验组质粒。常见的酶切位点如图 1 所示（更多信息请查看载体图谱）。

特别说明：在本方案中，pGreenⅡ 62-SK-BD 作为空载对照，pGreenⅡ 62-SK-BD-VP16 可作为转录激活活性的阳性对照。pGreenⅡ 62-SK-BD 空载具有较低本底表达水平，若转录激活因子构建到此载体上时，激活作用相比于本底显著性会更高，而阳性对照 pGreenⅡ 62-SK-BD-VP16 相对于本底具有极显著的表达水平，增加了系统的稳定性与可靠性。

 注：载体构建时要保证插入片段与 BD 结构域位于同一阅读框中，使插入片段与 BD 能够融合表达。

方案二：

将需要研究转录活性的目的序列（Y）构建到 pGreenⅡ 62-SK-BD-VP16 载体的 VP16 AD 结构域的下游 MCS 区，形成 pGreenⅡ 62-SK-BD-VP16-Y 实验组质粒。常见的酶切位点如图 2 所示（更多信息请查看载体图谱）。

特别说明：在本方案中，pGreenⅡ 62-SK-BD 和 pGreenⅡ 62-SK-BD-VP16 空载可作为对照。pGreenⅡ 62-SK-BD 空载具有较低本底表达水平，pGreenⅡ62-SK-BD-VP16 相对于本底具有极显著的表达水平，若转录抑制因子构建到此载体上时，由于抑制作用，会呈现出显著低于 pGreenⅡ 62-SK-BD-VP16 的表达水平，即可判断该蛋白（或蛋白区域）具有转录抑制活性。

 注：载体构建时要保证插入片段与 VP16 AD 结构域位于同一阅读框中，使插入片段与 VP16 AD 结构域能够融合表达。

二、原生质体检测

（1）去内毒素质粒提取

将本产品所提供的3种质粒及用户自行构建好的实验组质粒转化入大肠杆菌菌株 DH5α得到单克隆菌落。

1. 从平板上挑取含有相应质粒的大肠杆菌单菌落到 1 mL LB 培养基中（含有50μg/mL Kan），过夜培养。

2. 取 200μL 上一步得到的菌液到 200 mL LB 培养基中（kan⁺），过夜培养至 OD₆₀₀ 约 1.0-1.7（12-14 h）。

3. 采用去内毒素质粒大提试剂盒制备去内毒素质粒用于植物原生质体转化。详细制备过程参照试剂盒说明书。

（2）植物原生质体制备及转化

1. 根据所研究的物种，在本公司官网选择合适的原生质体制备及转化试剂盒或者自行制备原生质体及转化。本司已有烟草，玉米，番茄，小麦，水稻，拟南芥，柑橘，大豆，马铃薯，芸薹属等多种原生质体制备及转化试剂盒，更多产品信息请查阅本司官网或咨询本司技术人员。

2. 在转化过程中，将 Reporter 质粒与 Effector 质粒各取 3-6μg（总体积不大于 10μL）共转化制备好的植物原生质体，处理组合如表 1、表 2，每个处理重复4次（一个处理同时转化4管原生质体）。详细制备及转化方法请参考相应试剂盒的说明书或其它资料。

表 1 载体构建方案一原生质体转化组合

表 2 载体构建方案二原生质体转化组合

3. 室温孵育 16 h 后，进行双荧光素酶活性检测。

（3）双荧光素酶活性检测

1. 离心收集培养 16 h 后的原生质体，弃掉培养液。

2. 采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒，利用酶标仪的化学发光检测功能，分别测定 FLUC 和 RLUC的值，计算 FLUC/RLUC，即为相对荧光活性值（Relative luciferase activity）。详细实验方法请参考相应试剂盒的说明书或其它资料。

实验案例

采用植物转录活性检测试剂盒，在水稻原生质体中检测OsEIL1、OsJAZ9 和 OsTH1 的转录活性。结果如图 2 所示，GAL4 BD 具有本底表达活性；阳性对照 BD-VP16相对荧光素酶活性显著高于 GAL4 BD；实验组 BD-EIL1 相对荧光素酶活性显著高于 GAL4 BD，表明OsEIL1 具有转录激活活性；BD-JAZ9 和 BD-TH1 相对荧光素酶活性显著低于 GAL4 BD，表明 OsJAZ9，OsTH1 具有转录抑制活性。