还原型谷胱甘肽(GSH)含量检测试剂盒

CAT:HYYSB093-50T

可见分光光度法

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

规格：50T/48S

产品组成：

溶液的配制：

标准品: 10mg 还原型谷胱甘肽 (GSH)。临用前加入 1mL 蒸水溶解，浓度为 10m/mL。2-8℃可以保存6周。

产品说明：

谷胱甘肽是由谷氨酸(Glu)半胱氨酸(Cys) 和氨酸(Gy) 组成的天然三肽，是一种含巯基(-SH)的化合物，广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。谷胱甘肽能和 5,5’-二硫代-双(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）反应产生 2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物 (GSSG)。2-硝基-5-疏基苯甲酸为黄色产物，在波长 412nm 处具有最大光吸收。

DTNB

GSH         TNB + GSSG

技术指标：

最低检出限：2.67 ug/mL

线性范围：3.125-250 ug/mL

需自备的仪器及用品：

分析天平、匀浆器/研钵/细胞超声破碎仪、低温离心机、水浴锅、移液器、可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿。

操作步骤：

一、样本处理

1.组织处理:

新鲜组织首先用 PBS 冲洗2 次，然后称取动物组织或者植物组织 0.1g。加入试剂一润洗过的匀浆器中(匀浆器提前放冰上预冷):然后加入 1mL 试剂一 (组织/试剂一比例保持不变即可)，迅速冰上充分研磨(使用液氮研磨效果更好): 8000g，4C离心 10min; 取上清液放置于 4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存(可保存3 天)。

2.血液处理

血浆:将收集的抗凝血于 4℃,600g 离心10分钟,吸取上层血浆到另一支试管中,加入等体积的试剂一,4℃，8000g 离心10分钟,将上清移入新的试管中放置于 4℃待测,若暂时不能完成测试可放于-80℃保存(可保存 3 天)。

血细胞: 将收集的抗凝血于4℃，600g 离心10分钟，弃去上层血浆用3倍体积的 PBS 清洗3次(用PBS重悬血细胞，600g 离心10分钟)，加入等体积试剂一，混匀后 4℃放置10分钟，8000g 离心10分钟，吸取上清放于 4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存(可保存 3 天)。

3、细胞处理

收集不少于 500 万个细胞，首先用 PBS 清洗细胞 2次 (PBS 重悬细胞，600g离心10分钟)，加入1mL 试剂一重悬细胞，反复冻融 2-3 次(可在液氮中冻结，37℃水浴中溶解) 或者进行超声(200W，超 3s，停 10s，重复30 次)，8000g 离心 10 分钟，收集上清于4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存 (可保存 10 天)。

二、 测定步骤

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 412nm，用蒸馏水调零。

2、标准品的准备:吸取10mg/mL标准溶液,用蒸留水稀释至200ug/mL、100ug/mL、50ug/mL、25ug/mL、12.5ug/mL。

3、标准品稀释表:

4、加样表：在 1.5mL EP 管中分别加入下列试剂

三、GSH 含量计算

1.标准曲线的绘制 

据标准管的浓度（x，μg/mL）和吸光度 ΔA标准（y，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA（y，ΔA）带入公式计算样本浓度（x，μg/mL）。

2.GSH 含量计算：

（1）按蛋白浓度计算

GSH 含量（μg/mg prot）=x×V 样÷（V 样×Cpr）=x÷Cpr

2. 按样本质量计算

GSH 含量（μg/g 质量）=x×V 样÷(V 样÷V 样总×W)=x÷W

3. 按细胞数量计算

 GSH 含量（μg/10⁶cell）=x×V 样÷(V 样÷V 样总×N)=x÷N

4. 按血浆（血细胞）体积计算

 GSH 含量（μg/mL）=2x

V 样总：上清液总体积，1mL；V 样：加入反应体系中上清液体积，100μL=0.1mL；W：样本质量，g；Cpr： 上清液蛋白质浓度，mg/mL；N：细胞数量，以10⁶为单位计量；2：稀释倍数，血浆（血细胞）体积被稀释一倍。

注意事项：

1. 样本处理需匀浆完全，若当天不能完成测量，可放-80℃保存 3 天。
2. 若不确定样本中 GSH 含量的高低，可稀释几个梯度后再进行测量。
3. 因为试剂一中含有蛋白质沉淀剂，因此上清液不能用于蛋白浓度测定。如需测定蛋白含量，需另取组织。

4、 如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。