肌酸激酶（CK）活性检测试剂盒
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肌酸激酶（CK）活性检测试剂盒
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
规格： 50T/48S hyys90-50T
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致。
试剂名称
规格
保存条件
提取液
液体 60 mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
粉剂×1 瓶
-20℃保存
试剂二
粉剂×1 支
-20℃保存
试剂三
粉剂×2 支
-20℃保存
试剂四
粉剂×2 支
-20℃保存
试剂五
液体 15 mL×1 瓶
4℃保存
溶液的配制：
1、 试剂一：临用前加 10 mL 蒸馏水溶解；用不完的分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
2、 试剂二：临用前加入 0.5 mL 蒸馏水溶解；用不完的分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
3、 试剂三：临用前取 1 支加入 0.5 mL 蒸馏水溶解；用不完的分装后-20℃保存，禁止反复冻融； 4、 试剂四：临用前加入 0.65 mL 蒸馏水溶解；用不完的分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
5、 工作液：临用前根据用量将试剂一、试剂二、试剂三、试剂四、试剂五以 70:4:7:10:90 的比例混合（体积 比）。现用现配。使用前室温孵育 20min（该步骤不可省略）。
产品说明：
肌酸激酶（Creatine Kinase，CK） (EC 2.7.3.2)也成为肌酸磷酸激酶， 主要存在于心脏、肌肉以及脑等组织中， 能可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应，是一个与细胞能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要 激酶。
CK催化磷酸肌酸和ADP生成肌酸和ATP，己糖激酶催化ATP与葡萄糖形成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢 酶催化6-磷酸葡萄糖与NADP+生成NADPH，导致340nm光吸收值增加，以此来表示CK酶活。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者 增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
天平、低温离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计、 1mL石英比色皿、恒温水浴锅、研钵/匀浆器、蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1. 组织样本：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL提取液）
进行冰浴匀浆，然后10000g ，4℃离心15min，取上清，置冰上待测。
2. 血清样本：直接测定。
- 细胞样本：按照细胞数量（104个） ：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取 液）加入提取液，冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后于4℃ , 10000g 离心10min，取上清待测。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，用蒸馏水调零。
2、 操作表：在1mL比色皿中加入下列试剂
空白管
测定管
样本(μL）
200
工作液(μL）
450
450
H2O(μL）
550
350
在1mL石英比色皿中分别加入上述试剂， 充分混匀后于340nm处测定10s时的吸光值A1，迅速置于37℃ 水浴3min，拿出迅速擦干测定190s时的吸光值A2，计算ΔA测定管=A2测定-A1测定， ΔA空白管=A2空白-A1 空白， ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管。（空白管只需做1-2次）
三、CK 活性计算
1、 按组织蛋白浓度计算：
酶活定义： 37℃ , pH7.0 时，每毫克蛋白质每分钟催化产生1nmol NADPH为一个酶活单位。
CK活性（U/mg prot）=ΔA÷ (ε×d）×V反总×109÷(V样×Cpr) ÷T=268×ΔA÷Cpr
2、 按组织样本质量计算：
酶活定义： 37℃ , pH7.0 时，每克样本每分钟催化产生1nmol NADPH为一个酶活单位。
CK活性（U/g 质量） =ΔA÷ (ε×d）×V反总×109÷(V样÷V样总×W) ÷T =268×ΔA÷W
3. 按血清体积计算：
酶活定义： 37℃ , pH7.0 时，每mL血清每分钟催化产生1nmol NADPH为一个酶活单位。
CK活性（U/mL）=ΔA÷ (ε×d）×V反总×109÷V样÷T=268×ΔA
4. 按细胞数量计算：
酶活定义： 37℃ , pH7.0 时，每1万个细胞每分钟催化产生1nmol NADPH为一个酶活单位。
CK活性（U/104 cell）= ΔA÷ (ε×d）×V反总×109÷(V样÷V样总×细胞数量)÷T= 268×ΔA÷细胞数量
ε：NADPH的摩尔消光系数， 6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径， 1cm；V反总：反应体系总体积， 0.001L；V 样：反应体系中样本体积， 0.2mL；V样总：提取液体积， 1mL；Cpr：样本蛋白浓度， mg/mL；W：样本质量， g； 细胞数量：以104为单位，万个； T：反应时间， 3min；109 ：单位换算系数， 1mol=109nmol。
注意事项：
1. 血清的CK不稳定，采集样本后尽快测定， 4℃避光保存可稳定24h。
2. 样本蛋白质含量需要另外测定。
3. OD 值大于 0.6 可用提取液适当稀释样本，并在计算公式中相应的改变稀释倍数。
4. ΔA 空白管一般不超过 0.01。
实验实例：
1、 取0.1g小鼠脑加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清后再用提取液稀释4倍，之后按照测定步骤操作，用1mL 石英比色皿测得计算ΔA测定管=A2测定-A1测定=0.638-0.149=0.489 ，ΔA空白管=A2空白-A1空白=0 ，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.489-0=0.489，按组织样本质量计算酶活得：
CK活性（U/g 质量） =268×ΔA÷W×4（稀释倍数） =268×0.489÷0.1×4（稀释倍数） =5242.08 U/g 质量。
2、 取鸭血清200μL，按照测定步骤操作， 测得计算ΔA测定管=A2测定-A1测定=0.445-0.423=0.022，ΔA空白管=A2
空白-A1空白=0 ，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.022-0=0.022，按血清体积计算酶活得：CK活性（U/mL）=268×ΔA=268×0.022=5.896 U/mL。
