肌酸激酶(CK)活性检测试剂盒
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肌酸激酶(CK)活性检测试剂盒
注意:本产品试剂有所变动,请注意并严格按照该说明书操作。
规格: 50T/48S hyys90-50T
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致。
试剂名称
规格
保存条件
提取液
液体 60 mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
粉剂×1 瓶
-20℃保存
试剂二
粉剂×1 支
-20℃保存
试剂三
粉剂×2 支
-20℃保存
试剂四
粉剂×2 支
-20℃保存
试剂五
液体 15 mL×1 瓶
4℃保存
溶液的配制:
1、 试剂一:临用前加 10 mL 蒸馏水溶解;用不完的分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
2、 试剂二:临用前加入 0.5 mL 蒸馏水溶解;用不完的分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
3、 试剂三:临用前取 1 支加入 0.5 mL 蒸馏水溶解;用不完的分装后-20℃保存,禁止反复冻融; 4、 试剂四:临用前加入 0.65 mL 蒸馏水溶解;用不完的分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
5、 工作液:临用前根据用量将试剂一、试剂二、试剂三、试剂四、试剂五以 70:4:7:10:90 的比例混合(体积 比)。现用现配。使用前室温孵育 20min(该步骤不可省略)。
产品说明:
肌酸激酶(Creatine Kinase,CK) (EC 2.7.3.2)也成为肌酸磷酸激酶, 主要存在于心脏、肌肉以及脑等组织中, 能可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应,是一个与细胞能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要 激酶。
CK催化磷酸肌酸和ADP生成肌酸和ATP,己糖激酶催化ATP与葡萄糖形成6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖脱氢 酶催化6-磷酸葡萄糖与NADP+生成NADPH,导致340nm光吸收值增加,以此来表示CK酶活。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者 增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
天平、低温离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计、 1mL石英比色皿、恒温水浴锅、研钵/匀浆器、蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1. 组织样本:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g 组织,加入1mL提取液)
进行冰浴匀浆,然后10000g ,4℃离心15min,取上清,置冰上待测。
2. 血清样本:直接测定。
- 细胞样本:按照细胞数量(104个) :提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取 液)加入提取液,冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后于4℃ , 10000g 离心10min,取上清待测。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,用蒸馏水调零。
2、 操作表:在1mL比色皿中加入下列试剂
空白管
测定管
样本(μL)
200
工作液(μL)
450
450
H2O(μL)
550
350
在1mL石英比色皿中分别加入上述试剂, 充分混匀后于340nm处测定10s时的吸光值A1,迅速置于37℃ 水浴3min,拿出迅速擦干测定190s时的吸光值A2,计算ΔA测定管=A2测定-A1测定, ΔA空白管=A2空白-A1 空白, ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管。(空白管只需做1-2次)
三、CK 活性计算
1、 按组织蛋白浓度计算:
酶活定义: 37℃ , pH7.0 时,每毫克蛋白质每分钟催化产生1nmol NADPH为一个酶活单位。
CK活性(U/mg prot)=ΔA÷ (ε×d)×V反总×109÷(V样×Cpr) ÷T=268×ΔA÷Cpr
2、 按组织样本质量计算:
酶活定义: 37℃ , pH7.0 时,每克样本每分钟催化产生1nmol NADPH为一个酶活单位。
CK活性(U/g 质量) =ΔA÷ (ε×d)×V反总×109÷(V样÷V样总×W) ÷T =268×ΔA÷W
3. 按血清体积计算:
酶活定义: 37℃ , pH7.0 时,每mL血清每分钟催化产生1nmol NADPH为一个酶活单位。
CK活性(U/mL)=ΔA÷ (ε×d)×V反总×109÷V样÷T=268×ΔA
4. 按细胞数量计算:
酶活定义: 37℃ , pH7.0 时,每1万个细胞每分钟催化产生1nmol NADPH为一个酶活单位。
CK活性(U/104 cell)= ΔA÷ (ε×d)×V反总×109÷(V样÷V样总×细胞数量)÷T= 268×ΔA÷细胞数量
ε:NADPH的摩尔消光系数, 6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光径, 1cm;V反总:反应体系总体积, 0.001L;V 样:反应体系中样本体积, 0.2mL;V样总:提取液体积, 1mL;Cpr:样本蛋白浓度, mg/mL;W:样本质量, g; 细胞数量:以104为单位,万个; T:反应时间, 3min;109 :单位换算系数, 1mol=109nmol。
注意事项:
1. 血清的CK不稳定,采集样本后尽快测定, 4℃避光保存可稳定24h。
2. 样本蛋白质含量需要另外测定。
3. OD 值大于 0.6 可用提取液适当稀释样本,并在计算公式中相应的改变稀释倍数。
4. ΔA 空白管一般不超过 0.01。
实验实例:
1、 取0.1g小鼠脑加入1mL提取液进行匀浆研磨,取上清后再用提取液稀释4倍,之后按照测定步骤操作,用1mL 石英比色皿测得计算ΔA测定管=A2测定-A1测定=0.638-0.149=0.489 ,ΔA空白管=A2空白-A1空白=0 ,ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.489-0=0.489,按组织样本质量计算酶活得:
CK活性(U/g 质量) =268×ΔA÷W×4(稀释倍数) =268×0.489÷0.1×4(稀释倍数) =5242.08 U/g 质量。
2、 取鸭血清200μL,按照测定步骤操作, 测得计算ΔA测定管=A2测定-A1测定=0.445-0.423=0.022,ΔA空白管=A2
空白-A1空白=0 ,ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.022-0=0.022,按血清体积计算酶活得:CK活性(U/mL)=268×ΔA=268×0.022=5.896 U/mL。