农杆菌质粒提取试剂盒
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农杆菌质粒提取试剂盒(沉淀法)
市场上的基于碱变性法的质粒提取试剂盒都是为提取大肠杆菌质粒DNA 开发的，本产品是以之为基础上专门为农杆菌质粒DNA提取优化，其过程是首先菌体经离心悬浮后，被SDS和碱裂解细胞，并且碱使基因组DNA和质粒 DNA变性，随后用酸中和，质粒DNA可以快速复性，而基因组DNA不能快速复性，故可以通过离心去除。
农杆菌质粒提取试剂盒产品特点:
1. 专门为农杆菌质粒提取优化，不适用于非农杆菌。
2. 快速、步骤少，整个操作在40分钟左右完成。
3. 溶液B中有蓝色染料,便于目测非常关键的碱变性和中和反应两步的溶液混匀状
况，保证实验效果。
4. 产量高，一次可以处理1-5mL过夜培养的菌液，每毫升过夜培养的菌液可以提
取到 2-5 ug/mL(取决于质粒是高拷贝、中拷贝还是低拷贝)。
5. 本产品足够50次微量提取。
6. 纯度高,采用本试剂盒提取的质粒OD 比值在1.8-2.0之间,可以直接用于酶切、
转化、测序及PCR 等。
- 本产品只能用于科研。
农杆菌质粒提取试剂盒包装
农杆菌质粒DNA 纯化溶液A 15 mL
农杆菌质粒DNA纯化溶液B 30 mL
农杆菌质粒DNA 纯化溶液C 25 mL
RNase A溶液，10mg/mL 0.6 mL
去蛋白溶液 30 mL
质粒沉淀液 30 mL
DNA洗脱液 10 mL
农杆菌质粒提取试剂盒使用步骤
1. 从筛选平板上挑取农杆菌单菌落至含抗生素的培养基中，28℃震荡培养12-16小时(摇床转速200-300)，使其OD600 达到1.0-1.2。注意:建议使用YEP培养基，营养更丰富的培养基会使菌体浓度过高，超过纯化系统的处理能力而降低质粒 DNA的质量。另外，延长培养时间会因细胞死亡、裂解而造成质粒DNA浓度降低。
2. 用 1.5mL离心管收集1.5mL过夜培养饱和菌液，4℃ 12,000 rpm 离心 1分钟，弃上清，再短暂离心，吸弃残留液体。
3. 再加入1.5mL过夜培养饱和菌液，4℃ 12,000 rpm 离心 1分钟，弃上清，再短暂离心，吸弃残留液体。
4. 可以重复上步操作，直到累计得到3-5mL菌液沉淀。
5. 第一次使用本试剂盒时，先将本试剂盒提供的全部RNaseA溶液加入到农杆菌质粒 DNA 纯化溶液A(简称溶液A，下同)中，摇匀后再取用，未用完的溶液 A放 4℃保存。
6.用 1mL自备的无菌水洗涤细菌沉淀两次，即重悬细胞再离心弃上清。
7. 加入300uL冰上预冷的溶液A到上步得到的细菌沉淀中，用枪头充分吹打使菌体重悬。注意:细胞未充分悬浮会影响后续碱变性，可以使用漩涡振荡器混匀或使用枪头吸头吹打沉淀至完全混匀。
8. 室温放置 10分钟。
9. 加入 600 uL 农杆菌质粒DNA纯化溶液B(下面简称溶液B，如果溶液B在低温放置产生沉淀，须37℃加热溶解后冷却到室温方可使用)，温和颠倒5-6次混匀，蓝色将变得均匀并且溶液将变得粘稠。注意:千万不要剧烈振荡，也不要颠倒次数超过6次，否则基因组DNA断裂产生的片段非常容易污染质粒DNA。10.冰上放置不超过10分钟。注意:冰上放置不要超过10分钟，否则质粒 DNA会有碱损伤。溶液B用后需要将盖拧紧存放，否则空气中的二氧化碳会进入溶液，形成碳酸，中和溶液B中的碱，降低其效率。如果溶液B颜色不是蓝色，则表示变质，应该弃之不用并且跟厂家联系。
11.加入 450 uL冰上预冷的农杆菌质粒DNA纯化溶液C(下面简称溶液 C) ，温和反复颠倒 4-6次，溶液将变成无色，将有白色絮状沉淀产生。
12.冰上放置至少10分钟让质粒DNA复性。不能短于10分钟。
13.在 4℃下 12,000 rpm 离心5分钟，小心将上清液转移到两个新离心管中，每管600uL。由于此时的溶液比重较大，部分絮状物悬浮在上清液中属正常现象，吸取上清时避开这些悬浮物即可。
14.加入 0.6mL 去蛋白溶液，充分震荡2分钟。
15.4℃12,000rpm 离心2分钟，取水相(无色部分)到新的离心管中，不要取有颜色的部分。
16.加等体积的质粒沉淀液，颠倒30秒混匀后4℃12,000 rpm 离心 15 分钟，质粒 DNA将形成沉淀，弃上清。
17.加入1mL 的通自备75%乙醇，室温12,000 rpm 离心 1分钟，弃上清。
18. 室温 12,000 rpm 离心 1分钟，取出残留液体(约50uL) 。
19.室温短暂放置半分钟。
20.加入 DNA洗脱液50-100uL重悬沉淀，即得质粒DNA溶液。可以直接用于后续实验。
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