quick RNA isolation kit

quick RNA isolation kit  GX

植物RNA提取试剂盒V1.6 GX型

用于各种植物样本的RNA提取多次优化的裂解液，不使用酚和氯仿，高效去除多糖多酚使用DNase I柱上消化技术，彻底去除基因组DNA残留

◆产品编号：0416-50GX

◆常温运输、保存

◆本产品仅供科研使用

一、产品特点：                  客户不需要准备氯仿和其他任何试剂

本产品用于多种植物样本（包括含多糖多酚的植物样本）的RNA提取，包括植物的根、茎、叶、花、果实、种子、花粉、块茎等。目前已成功用于葡萄叶、棉花、黑加仑、草莓、猕猴桃叶、月季、桃树、苹果、梨树、杜鹃、枇杷、石斛、猕猴桃、苹果、葡萄、桃树、火龙果、红薯、芒果、黄瓜、西红柿、水稻种子、小麦种子、玉米种子、毛柄金钱菌等植物样本的RNA提取。

本产品经特别优化的溶液A能能迅速裂解细胞并灭活细胞内的RNA酶，同时高效去除植物样本中的多糖多酚；含有RNA的上清液与溶液B混和后，RNA能在离心时选择性吸附于RNA吸附柱内的硅基质膜上；另外，绝大部分DNA会在离心时随溶液穿过吸附膜。结合DNase I柱上消化技术，可以彻底去除基因组DNA残留，再经过漂洗、离心等步骤，最后用RNase-free H₂O进行洗脱，得到高纯度的RNA。得到的RNA基本无DNA残留，可用于RT-PCR，Northern-blot和各种后续实验。

二、规格及组成：

三、使用方法：

注意事项：

若溶液A在低于4℃环境下长时间存放，可能会出现浑浊或有固体物质析出。若出现上述现象，需将溶液A在50-60℃水浴中加热至少10min，使固体析出物彻底溶解，溶液恢复澄清，充分摇匀后才能使用，否者容易引起RNA提取结果异常。

1. 根据植物样本的种类及组织部位的特点来确定初次提取时样本的用量，具体可以参考下表。

注意事项：

a.对于富含多糖多酚的样本（如蔷薇科等），若用量过多，则容易导致多糖残留，从而影响最终RNA的纯度；若用量过少，通常只会引起最终RNA的产量偏低，不会引起RNA纯度变化。

b.对于不含多糖多酚的样本（如禾本科），样本用量通常只会影响最终RNA的产量，不会引起RNA纯度偏低；但是过多的样本可能会导致在第一次离心结束后很难吸取足够体积的上清液（步骤4）。

c.对于含水量较高的样本，增加样本用量（相对叶片而言）实际上是为了保证提取时有足够的细胞数量，但是切勿超过推荐的最高样本用量，否则样本中大量的水分会对裂解液造成严重的稀释，从而改变裂解液中各组分的有效浓度，容易造成RNA提取效率下降，并可能引起RNA纯度异常。

d.对于含水量偏低的样本（如小麦干种子），由于需要消耗裂解液中一部分水去溶解样本中的高吸水物质（如淀粉），在实际裂解过程中会引起裂解液一定程度的“浓缩”。但是过多的样本会引起裂解液过度地“浓缩”，同样可能会造成RNA提取异常。

e.对于称重不便或液氮保存的样本，可以根据样本的体积（果实样本）或面积（叶片样本）来估算样本的重量；或者在液氮中将样本研磨成粉末后，根据所取的粉末量来估算样本重量。

2. 直接研磨法：

取适量植物组织迅速剪成小块放入研钵，加入1ml 溶液A，室温下充分研磨后转入1.5ml离心管。研磨过程中应让溶液A和破碎后的植物组织充分接触，以抑制RNA酶活性。

液氮研磨法：

取1ml 溶液A，转入1.5ml离心管中备用。在液氮中将植物组织研磨成细粉后，取适量细粉转入上述装有溶液A的离心管中，剧烈摇晃振荡20秒，充分裂解。

3. 室温，12,000×g 离心5~8 分钟，沉淀细胞碎片和杂质，以便分离出清澈透明的上清液。

应该出现的正常现象：

a.离心结束后，植物细胞碎片应在试管底部形成较致密的沉淀，与上清液分界明显，在吸取上清时不会有固体杂质被同时吸走；

b.上清液应清澈透明，通常呈绿色或其它颜色；上清液上部无漂浮物，偶尔有少量漂浮物，但不会影响吸取上清液。

可能出现的异常现象：

a.离心结束后，不能在试管底部形成致密的沉淀，即使很缓慢地吸取上清，仍然会有部分杂质进入吸头；

b.上清液上部有明显的漂浮物或其它类似“油污”的物质，通常与样本含有较多的蛋白质或脂类物质有关。

4. 转移700~800μl上清液到一干净的2ml离心管中，避免吸入底部杂质。

注意事项：对于水果等富含水分的样本，离心后上清液的体积会超过1ml。如果期望更高的RNA产量，建议尽可能多地吸取上清液，但应避免吸入底部的杂质。若不慎吸入杂质，可以再次离心后重新吸取上清液。

5. 加入等体积的溶液B，立即吹打或涡旋混匀。

注意事项：请勿剧烈振荡，否则容易产生大量泡沫，反而使液体难以混匀。

应该出现的正常现象：

加入溶液B并混匀后，液体仍然保持清澈透明，不会出现浑浊或析出沉淀；混匀后，液体上部可能出现少量泡沫；

可能出现的异常现象：

溶液出现浑浊或析出絮状沉淀，通常与样本中存在较多的多糖、蛋白质或脂类物质有关。

6. 将混合物(每次最多700μl，多可以分两次加入)加入到一个RNA吸附柱中，室温，12,000×g 离心1分钟，弃掉废液。

应该出现的正常现象：

a.通常，液体在上述离心条件下可以全部过滤，若有未过滤的液体，再次离心2-3分钟即可全部过滤；

b.离心结束后，吸附柱的膜应为白色或接近白色，不应有绿色、棕色、红色等色素残留。

可能出现的异常现象：

a.液体难以过滤，延长离心时间至3分钟，仍有液体残留。通常是因为离心过程中，样本所含的多糖或其它大分子在吸附膜表面出现堆积或黏附，堵塞了吸附膜的孔隙而引起过滤困难。出现这种情况时，通常最终RNA纯度可能会偏低，重复提取时可以减少样本用量；

b.离心结束后，吸附柱的膜上出现绿色、棕色、红色等色素残留；

c.吸附柱的塑料内圈位置出现可见的沉淀或杂质。

7. 可选步骤：（膜上消化DNA）

a.加入700μl 漂洗液，室温，12,000×g 离心1分钟，弃掉废液。

b.室温，12,000×g 离心2分钟。此步非常重要，否则残留的乙醇会抑制DNase I的活性。

c.将5~6μl的Recombinant DNase I加入到45~44μl DNase I Buffer中吹打混匀配制成50μl的DNase I工作液，然后将50μl的DNase I工作液滴加到吸附柱的膜上，室温静置15～20分钟。

8. 加入500μl 漂洗液，室温12,000×g 离心1分钟，弃废液。再加入500μl 漂洗液，再次离心。
9. 将RNA吸附柱放回空的收集管中，室温，12,000×g 离心2分钟。此步非常重要，否则残留的乙醇会影响RNA的使用。
10. 将RNA吸附柱放入一个RNase-free 离心管中，直接在吸附膜的中间部位加50～100μl （推荐50～70μl）RNase-free H₂O，室温放置3~5分钟。

应该出现的正常现象：

干净无污染的吸附膜有非常强的吸水性，所以当水滴加在膜上时，水分会被吸附膜迅速吸收并均匀分散在整个吸附膜中，膜表面无可见的水分。当加水50-80μl时，水分通常会在约3秒内被迅速吸收。

可能出现的异常现象：

加水后，水分吸收缓慢，能观察到明显的水分滞留在膜的表面。这种情况通常是由于吸附膜表面被多糖或其它大分子物质污染，导致膜吸水速度变慢。

11. 室温，12,000×g 离心2分钟。离心管中溶液即为RNA样品，可以立即使用或存放于-80℃待用。

应该出现的正常现象：

a.洗脱液应透明无色，洗脱体积与加入水的体积基本一致；

b.电泳时RNA条带分离清楚，RNA条带不扩散、无拖尾；溴酚蓝等指示染料电泳时不出现滞后；

c.根据样本类型不同，可能出现极少的基因组DNA残留。

可能出现的异常现象：

a.洗脱液带有较浅的绿色或棕色，或长时间放置后出现较浅的棕色，通常与酚类物质残留有关；

b.洗脱体积远小于加入水的体积，通常与吸附膜上残留多糖等吸水比较强的物质有关；

c.出现较多的基因组残留。