细胞增殖-毒性检测试剂盒 (CCK-8)

细胞增殖-毒性检测试剂盒 (CCK-8)

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保存条件：CCK-8 溶液在避光，0-5℃的条件下可以保存一年；  -20℃下保存 2 年；如需经常使用请将试剂存放在 0-5℃，为防止背景值增加干扰实验结果， 请勿反复冻融。

产品内容：

 

产品名称	500T	10000T
CCK-8  (Cell Counting Kit-8)	5×1mL	100m L
说明书	1 份

 

产品说明：CCK8  试剂盒提供了一种灵敏度高，操作简便，使用安全，重现性好 的细胞增殖与活性检测方法。与传统的 MTT  相比无需有机溶剂和放射性同位素， 步骤少，无损失，结果准确！本试剂盒检测非常便捷。试剂盒仅一管已经配制好的 含有 WST-8  的 CCK-8  溶液，无须再进行任何配制等操作 。无须使用同位素，所有 的检测步骤仅在同一块 96  孔板内完成。不必洗涤细胞，不必收集细胞，也不必采 用额外的步骤去溶解 formazan 。可以用于大批量样品的检测。

1.  本试剂无毒，使用中无需有机溶剂，操作更加安全。

2.  酚红和血清对 CCK  法的检测不会造成干扰 (扣除空白孔即可)。

一：通用操作步骤

6.  在 96  孔板每孔加入 100u L  细胞悬液；

7.  在培养箱中预培养细胞；

三：细胞活性检测

1.  在 96  孔板中接种细胞悬液 (100µ L/孔) 。将培养板放在培养箱中预培养 (在 37℃,5% CO2  的条件下)；

2.   向每孔加入 10 µ L  的 CCK -8 溶液 (注意不要在孔中生成气泡，它们会影 响 OD  值的读数)；

3.  将培养板在培养箱内孵育 1-4  小时；

4.  用酶标仪测定在 450nm  处的吸光度；

5.  如果暂时不测定 OD  值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入 10 µ L

0.1M   的 HCL  溶液或者 1% w/v SDS  溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件 下。在 24  小时内吸光度不会发生变化。

四：细胞增值-毒性检测

使用方法 (以 96  孔板为例，其他规格培养板按实际情况安排)：

1.  在 96  孔板中配置 100µl  的细胞悬液(通常细胞增殖实验每孔加入 100µl 2000  个细胞，细胞毒性实验每孔加入 100µl 5000  个细胞。具体每孔所用的细胞 的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等因素决定) 。按照实验需要， 进行培养 (在 37 °C ，5%CO2, ，的条件下) 预培养 24  小时；

2.   向培养板加入 1-10µl  不同浓度的待测药物刺激；

3.  将培养板在培养箱孵育一段适当的时间 (后面有具体细胞的建议时间，例

如：6 、12 、24  或 48  小时)；

4.  每孔加入 10µlCCK-8  溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响 OD  值 的读数) 。如果起始的培养体积为 200µl ，则需加入 20µl CCK-8  溶液，其他情况 以此类推。可以用加了相应量细胞培养液和 CCK-8  溶液但没有加入细胞的孔作

空白对照。如果担心所使用的药物会干扰检测，需设置加了相应量细胞培养液、药 物和 CCK-8  溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照；

5.  在细胞培养箱内继续孵育 1-4  小时，对于大多数情况孵育 1  小时就可以 了。时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定，初次实验时可以在 0.5 、1、2  和 4  小时候分别用酶标仪检测，然后选取吸光度范围比较适宜的一个时

间点用于后续实验；

6.  用酶标仪测定在 450nm   处的吸光度 ，如无 450nm  滤光片 ，可以使用 420-480nm   的滤光片。可以使用大于 600nm   的波长，例如 650nm ，作为参考波 长进行双波长测定；

7.  如果暂时不测定 OD  值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入 10µl 0.1M 的 HCL  溶液或者 1% w/v SDS  溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在 24 小时内吸光度不会发生变化；

8.  注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加 CCK  之前更换新鲜培 养基 (除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基) ，去掉药物

影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基 中加入药物后的空白吸收即可。

五：活  计算

细胞活力*  (％) = [A(加药)-A  (空白) ]/[A  (0 加药) -A  (空白) ]   ×100 A  (加药)：具有细胞、CCK 溶液和药物溶液的孔的吸光度

A  (空白)：具有培养基和 CCK 溶液而没有细胞的孔的吸光度

A  (0 加药)：具有细胞、CCK 溶液而没有药物溶液的孔的吸光度

*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力

六：细胞增殖分析

1.  制备细胞悬液；

2.  接种到 96  孔培养板 ；

3.  37℃培养箱中培养 ：细胞接种后贴壁大约需要培养 24  小时,不需要贴壁的

话，可以省去这个步骤；

4.  加入 10ul  的 CCK-8 :   由于每孔加入的 CCK-8  量比较少，有可能会因试剂沾 在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀；

5.  培养 1-4  小时：细胞的种类不一样，形成的 Formazan  的量也不一样，如 果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件，特别是血液细胞形成的 Formazan 很少，需要较长的显色时间 (5-6  小时)，  如果颜色不均匀的话，可以轻轻敲击培 养板以帮助混匀；

6.  测定 450nm  吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长 450-490nm,参 比波长 600-650nm。

七：细胞毒性分析

1.  制备细胞悬液；

2.  接种到 96  孔培养板；

3.  37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养 24  小时，不需要贴壁的

话，可以省去这个步骤；

4.  加入不同浓度的毒性物质；

5.  加入 10u L  的 CCK-8 ：加入毒性物质的培养时间，要看毒性物质的性质和细 胞的敏感性，一般要根据细胞周期来决定，起码要一代以上的周期；

6.  培养 1-4  小时： 由于每孔加入的 CCK-8  量比较少，有可能会因试剂沾在孔

壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀；

 

7.  测定 450nm  吸光度：如果颜色不均匀的话，可以轻轻敲击培养板以混匀， 建议采用双波长进行测定，检测波长 450-490nm,  参比波长 600-650nm；

8.  IC50  的计算方法：

按照以下公式计算细胞存活率，绘制成图表，细胞存活率 50%的值即为 IC50 . 细胞存活率 (%) = [(As-Ab)/(Ac-A b)]×100%

As:实验孔 (含有细胞的培养基、CCK-8 、毒性物质)

Ac ：对照孔 (含有细胞的培养基、CCK-8 、没有毒性物质) Ab ：空白孔 (不含细胞和毒性物质的培养基、CCK-8)

八：注意事项

5.   由于使用 96  孔板进行检测，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发的问 题。一方面， 由于 96  孔板周围一圈最容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法， 改加 PBS，水或培养液；另一方面，可以把 96  孔板置于靠近培养箱内水源的地方， 以缓解蒸发；

6.  CCK-8  检测细胞活性的原理是通过检测活细胞脱氢酶催化的反应。任何待测 体系中存在还原剂，例如一些抗氧化剂会干扰检测，需设法去除。如果待测物质有 氧化性或还原性的话，可在加 CCK-8  之前更换新鲜培养基，去掉药物的影

响。当然药物影响比较小的情况可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后 的空白吸收即可；

7.  建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入 CCK-8  试剂后的培养时间；

8.  建议采用多通道移液器，可以减少平行孔间的差异。加入 CCK  试剂时，建

议斜贴着培养板壁加，不要查到培养基液面下加样，溶液产生气泡，会干扰 OD  值 读数；

 

9.  当使用标准 96  孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为 1000  个/孔 (100µl

培养基) 。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于 2500  个/孔，

(100µl  培养基)，且培养时间长一些。如果要使用 24  孔板或 6  孔板实验，请先

计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的 10%加入 CCK-8  溶液；

10.  加入 CCK-8  溶液时，如果细胞培养时间较长，培养基颜色已变化或 PH  值

变化。建议换用新鲜的培养基；

11.  如果没有 450nm   的滤光片，可以使用吸光度在 430-490nm  之间的滤光

片，但是 450nm  滤光片的检测灵敏度最高；

12.  酚红和血清对本试剂盒的测定无明显影响。培养基中酚红的吸光度可以在

计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。

13.    为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。