MBP标签蛋白纯化试剂盒 （冻融法）

 

 

MBP标签蛋白纯化试剂盒 （冻融法）

MBP-Tag Protein purification Kit

hyykb980-10T

产品内容：

产品组分	规格（10T）	储存温度
Dextrin Beads（50%）（切勿冷冻！）	5 mL	2-8℃
冻融法裂解液（仅 II 型提供）	70 mL	2-8℃
洗涤液	125 mL	2-8℃
洗脱液	70 mL	2-8℃
层析柱（6 mL）	10 个	常温
PMSF 溶剂	1 mL	2-8℃
PMSF 干粉	20mg	2-8℃

运输及储存条件：蓝冰运输；各组分按照表中所示温度进行储存，保质期18个月；PMSF 溶解后需-20℃储存，保质期12个月。

MBP标签蛋白纯化试剂盒

产品介绍：

MBP（麦芽糖结合蛋白，Maltose Binding Protein）由大肠杆菌K12的malE 基因编码，蛋白大小约 42kDa，可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，促进融合蛋白的正确折叠，尤其适用于真核蛋白。

本试剂盒可满足10次 MBP 标签蛋白的纯化（50 mL体积的细菌），提供5 mL浓度为50%的Dextrin Beads介质，每mL介质可吸附~20 mg (80 kDa) MBP 标记的蛋白质。实际使用情况与分子量大小和蛋白特性相关，纯化量有所差别。本试剂盒只能在非变性条件下使用，只可用于纯化没有形成包涵体的可溶性 MBP 标签蛋白。

MBP标签蛋白纯化试剂盒

操作步骤：

• 重组蛋白的表达和细菌收集

1.将目的质粒转化大肠杆菌表达感受态（Rosetta-DE3(CC555)/BL21-DE3(CC553)），菌P鉴定后挑单克隆，接种到3-5 mL含适当抗生素的LB 液体培养基中，37℃培养过夜。

2. 按照 1:100 的比例取培养过夜的菌液，接种到含抗生素的 LB 液体培养基中。

      注：具体的培养体积根据需要纯化的蛋白量而定。

3.  37℃振荡培养直到OD 600达到0.6-0.8。

4.  加入IPTG至终浓度为1 mM，16℃振荡培养18-20 h或37℃振荡培养3-4 h。

 

注：首次尝试建议用不加诱导物的菌液做对照。对于特定蛋白的诱导表达，最佳的IPTG浓度、诱导温度和时间需要通过实验确定。

 

 

5.取50 mL表达菌液，5000×g，4℃离心10 min，弃上清，收集沉淀。沉淀可直接用于裂解或置于-80℃冻存备用（如选配冻融法裂解，可将沉淀与裂解液充分混匀后再冻存）。

 

二、裂解（超声破碎/冻融法，二选一）

1. 超声破碎细菌：在50 mL 细菌沉淀中加入2.5 mL 冰浴的超声裂解缓冲液，再加入60μL PMSF（10 mg/mL）溶液，冰上超声裂解菌体直到在显微镜下看见 90%以上细胞破裂。超声参考条件：功率200-300 W，每次超声处理10 s，间隔10 s，共超声处理15 min。

注：根据 MBP 标签蛋白表达丰度，菌液和超声裂解缓冲液的体积比可以在 25:1-5:1 范围内适当调整。超声参数需根据仪器型号自行摸索和优化。

 

2. 冻融法裂解细菌：在50 mL细菌沉淀中加入5 mL冰浴的冻融裂解液，再加入 60μL PMSF（20 mg/mL）溶液，将裂解液和菌体沉底打散混匀，置于-20℃及以下冰箱冷冻结实，取出后室温自然化冻，轻轻涡旋数下，以充分裂解细菌，尽量避免产生气泡。

注：根据MBP标签蛋白表达丰度，菌液和冻融裂解缓冲液的体积比可以在 30:1-10:1 范围内适当调整。裂解物必须不粘稠，否则会堵塞层析柱。

3. 将超声裂解法或冻融解法得到的细胞裂解物在13,000×g，4℃离心10 min。吸取上清即为MBP 标签融合蛋白溶液。

 

4.（选做）如果裂解后上清非常粘稠，可加入全能核酸酶降解核酸，降低上清粘稠度，或者使用注射器反复抽吸，以剪切粘稠的基因组DNA等。然后再次离心。

注：预留少量（如100 μL）作为裂解液留样进行SDS-PAGE电泳检测，其余用于纯化

 

三、MBP标签蛋白纯化

1. 将 Dextrin Beads 充分混匀，用剪过的枪头吸取0.5 mL 介质于15 mL离心管中（自备），1000×g、4℃离心30 s，去上清。

 

2. 加入0.25 mL洗涤液重悬平衡介质，离心去上清，重复平衡2-3次。

 

注：介质用量需要根据 MBP 标签蛋白产量决定，请根据实验需要取适量的

Dextrin Beads进行实验，洗涤液平衡介质体积按照比例进行增减。

 

3. 加入蛋白裂解液上清，将介质重悬均匀后在 4℃侧摆摇床或水平摇床上结合 1-12 h（初次操作结合时间可设置在2-4 h 检测结合效果后进行调整）。

 

4. 放一片筛板至层析柱并盖上底部盖子，用剪去尖端的吸头吸取上清与介质混合液至层析柱，取掉盖子，在自然重力下让裂解液自然流出，收集流穿液留作后续SDS-PAGE 电泳。

 

 

5. 用1 mL洗涤液洗柱 3-5 次，收集并保存每次的洗涤液，进行SDS-PAGE电泳，并根据电泳结果中蛋白残留情况增减洗涤次数。

 

6. 用2 mL洗脱液洗脱1-3 次，收集并保存每次洗脱液，进行SDS-PAGE电泳，根据电泳结果中蛋白洗脱情况增减洗脱次数。

 

注：若使用的洗脱液体积较少，添加后未能将介质完全覆盖，可能存在洗脱不充分的情况，此时可将洗脱液重新加入层析柱或多次洗脱以提高蛋白回收率。也可根据所需蛋白浓度适当调整洗脱体积。

 

7. 洗脱后，依次使用3倍柱体积（指Dextrin Beads体积，下同）的洗涤液和5倍柱体积的去离子水平衡介质，最后再用5倍柱体积的 20%的乙醇平衡，然后保存在等体积的 20%的乙醇中，置于 4℃保存，防止填料被细菌污染。本介质可重复使用。

 

五、在位清洗

Dextrin Beads 纯化产品可以重复使用而无需再生，但随着非特异性结合的蛋白的增多和蛋白的聚集，往往造成流速和结合载量都下降，需要进行在位清洗操作（Cleaning-in-Place，CIP），具体操作如下：

1.  5倍柱体积的去离子水清洗。

2.  3倍柱体积的 0.1% SDS 或0.5M NaOH溶液洗杂。

3.  5倍柱体积去离子水清洗。可以立即使用，如不立即使用，用5倍柱体积的 20%的乙醇平衡，然后保存在等体积的 20%的乙醇中，置于 4℃保存。

MBP标签蛋白纯化试剂盒

常见问题与解决建议

1. 裂解液中目的蛋白含量低

(1) 感受态活力不足，重新转化大肠杆菌表达感受态。

(2) 调整蛋白表达条件：如IPTG浓度、诱导温度和时间等

 

2. 蛋白无法与介质结合，或结合效率较低

(3) 尽量使用新鲜诱导表达的菌液。

(4) 收集流穿反复上样或增加蛋白与介质结合时间（如 4℃过夜）。

(5) 融合蛋白使麦芽糖结合位点阻塞或扭曲影响了目的蛋白的结合力，更换载体或在融合蛋白与标签间添加 linker 以增加二者间距离。

(6) MBP标签丢失或未表达，WB检查MBP标签并测序检查基因序列的读码框是否正确。

(7) 样品或缓冲液中存在一些干扰因素如非离子去污剂，样品透析或用结合缓冲液稀释。

(8) 细胞产生大量的淀粉酶影响结合力，培养基中添加葡萄糖，抑制淀粉酶的表达。

3. 纯化目的蛋白纯度较低

(1) 上样量太大，洗涤液洗涤不彻底。

(2) 平衡/洗涤不充分，增加结合缓冲液液体积，确保介质充分平衡/洗涤，如介质太脏在位清洗（CIP）步骤进行介质清洗。

 

 

 

 

(3) 杂蛋白为目的蛋白降解片段，蛋白样品收集后宜尽快完成纯化工作，并应始终放置在 4℃或冰浴，减缓蛋白降解。为有效抑制蛋白降解，可以在裂解液中添加适量的蛋白酶抑制剂混合物，例如蛋白酶抑制剂混合物（细菌，100×）或蛋白酶-磷酸酶复合抑制剂（100×）。

 

4. 蛋白在纯化过程中形成沉淀或聚集

(1) 控制纯化过程中的温度，避免温度过高或过低，一般在4℃左右进行纯化可减少蛋白沉淀或聚集。

 

5. 层析柱堵塞或流速较低

(1) 上样样品含杂质颗粒，将样品过滤通过0.22μm或0.45μm的滤膜过滤，或在13,000×g，4℃离心离心15 min或更长时间。

(2) 非特异性结合的蛋白的增多和蛋白的聚集，按照在位清洗（CIP）步骤进行介质清洗

 

注意事项：

1. 请勿在-20℃或更低温度冷冻保存 Dextrin Beads。

2. 保存和纯化过程中应始终保持纯化凝胶介质湿润。

3. 纯化过程中的各步骤留样体积根据具体纯化体积确定，仅供参考。

4. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得存放于普通住宅内。

5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。