Rosetta(DE3)pLysS感受态细胞 Rosetta(DE3)pLysS Chemically Competent Cell

Rosetta(DE3)pLysS感受态细胞

Rosetta(DE3)pLysS Chemically Competent Cell

Cat:Hyywb809    10*100ul

基因型

F- ompT hsdSB(rB- mB- ) gal dcm(DE3)pLysSRARE(CamR) 

Rosetta(DE3)pLysS感受态细胞

产品说明

Rosetta(DE3)pLysS 菌株携带pLysSRARE质粒，具有氯霉素抗性。pLysSRARE含有表达T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶可以作用于大肠杆菌细胞壁上的肽聚糖溶解大肠杆菌，还可与T7 RNA聚合酶结合抑制其转录活性，进而降低目的基因的背景表达水平，但不干扰IPTG诱导的表达，适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白；pLysSRARE同时补充大肠杆菌缺乏的6 种稀有密码子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA)对应的tRNA，提高外源基因，尤其是真核基因在原核系统中的表达水平，该菌株染色体整合了λ噬菌体DE3区 (DE3区含有T7噬菌体RNA聚合酶)，该区整合于大肠杆菌的染色体上，可同时表达T7 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶，用于pET系列，pGEX，pMAL等质粒的蛋白表达。Rosetta(DE3)pLysS感受态细胞由特殊工艺制作

Rosetta(DE3)pLysS感受态细胞

操作方法

1. Rosetta(DE3)pLysS感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的质粒，并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。

2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。

3. 向离心管中加入700 μl不含抗生素的无菌培养基 (2YT或LB)，混匀后37℃，200 rpm复苏60分钟。

4. 5000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含34 µg/ml氯霉素及所选质粒筛选抗生素的2YT或LB培养基上。

5. 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

蛋白小量诱导表达Protocol (for reference only)

1. 小摇接菌：在透气试管或透气离心管中准备1-3ml 含相应抗生素的液体LB（或2YT、TB、SB等营养丰富培养基），接入一个含有目的质粒的新鲜单菌落。

2. 37℃，200 rpm过夜摇菌约10-15h。

3. 大摇接菌：将第一步的小摇菌液按1-2%比例接菌到50ml 含相应抗生素的LB（或2YT、TB、SB等营养丰富培养基），为增加溶氧，最好使用500ml 三角瓶（加入营养液的体积一般为三角瓶标定体积的1/10，最高不超过1/5）。

4. 37℃，150 rpm摇菌到OD600值为0.5-0.8（一般需要2-4h）。

5. 空白对照取样（可选步骤）：在加入诱导剂IPTG前可取样1ml菌液到1.5ml 离心管中，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀放-20℃保存待用。  

6. 第四步的三角瓶中加入IPTG至终浓度为1mM（IPTG浓度可自由调整），继续37℃，120 rpm摇菌2-4h。

7. 不同时间点取样（可选步骤）：最佳摇菌时间与所表达蛋白有关，表达蛋白不同最佳摇菌时间不同，为找到最佳诱导时间可在不同诱导时间点取样（例：在诱导第2h，4h，6h，8h，14h取样，离心后放-20℃保存）。

8. 离心收菌：三角瓶从摇床拿出，埋入冰中10 分钟， 4℃，5000g，10分钟离心，弃上清，沉淀保存在-20℃。

9. 待所有样品准备妥当，可以做SDS-PAGE分析蛋白表达。