AH109-GAL4 系统酵母双杂互作验证试剂盒
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AH109-GAL4 系统酵母双杂互作验证试剂盒
产品货号: hyyp8031
储存条件: 请按产品包装要求储存，有效期一年。
产品组分:
类别
单品货号
名称
规格
Store
培养基
HYYp80
SD/-Leu/-Trp Broth
0.5L
RT
HYYp81
SD/-Leu/-Trp with Agar
3×0.5L
RT
HYYp82
SD/-His/-Leu/-Trp with Agar(备用)
0.5L
RT
HYYp83
SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp with Agar
3×0.5L
RT
筛选试剂
HYYp84
X-a-gal(20mg/mL,过滤除菌)
5×1ml
-20℃
HYYp85
3-AT(2.5M,过滤除菌)
25ml
4℃
质粒
HYYp86
p G A D T 7 质 粒
10μl
-20℃
HYYp87
pGB KT7质粒
10μl
-20℃
对照质粒
HYYp88
pGBKT7-53质粒
10μl
-20℃
HYYp89
pGADT7-T质粒
10μl
-20℃
HYYp90
pGBKT7-Lam质粒
10μl
-20℃
感受态细胞
HYYp91
AH109感受态细胞
20×100μl
-80℃
注:
1. 本试剂盒提供的产品以产品组成为准，大概能用于 10 对双杂互作验证（质粒除外）。
2. 各组分需按照标签温度储存，感受态细胞务必-80℃保存。
3. 3×0.5L 代表：3 个包装，每个包装 0.5L；5×1mL 代表：1 个包装，含 5 个 1mL。
4. 本方案不适用大批量酵母双杂交实验，因为诱饵蛋白表达、自激活检测和毒性验证应该预先完成。
5. 感受态细胞配带有 Carrier DNA 和 PEG/LiAc。
6. 载体序列，在我司网站可以下载。
产品简介:
酵母双杂的原理基础：很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA 特异结合域（DNA-binding domain,BD）与转录激活域（Transcriptional activationdomain，AD）。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域，否则无法完成激活功能。不同来源激活因子的 BD 区与 AD 结合后则特异地激活被 BD 结合的基因表达。基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使 AD 与 BD 形成一个完整的转录激活
因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白系统。分子间是否发生了相互作用。
酵母双杂交系统由三个部分组成：（1）与 BD 融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白（bait）。（2）与 AD 融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白（prey）。（3）带有一个或多个报告基因的宿主菌株。常用的报告基因有 HIS3，URA3，LacZ 和 ADE2 等。而菌株则具有相应的缺陷型。双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。根据目前通用的系统中 BD 来源的不同主要分为 GAL4 系统和 LexA，目前常用的是 Y2HGold-GAL4 和 AH109-GAL4 系统。AH109 是 GAL4 系统酵母双杂实验用菌株，MATa 型，可直接转化质粒或与 MATa 型酵母菌株 Y187通过 mating 操作进行蛋白互作验证或筛库试验。Transformation marker 为：trpl，leu2，报告基因为：lacZ，HIS3，ADE2，MEL1。AH109-GAL4 酵母双杂系统需要两种质粒配套使用：pGBKT7 和 pGADT7。质粒pGBKT7 的筛选标志为 TRP1，用于表达 DNA-BD（来自酵母转录因子 GAL4N 端 1~174 位氨基酸）与目标蛋白（Bait）的融合蛋白：质粒 pGADT7 的筛选标志为 LEU，用于表达 AD（GAL4C 端 768~881 位氨基酸）与目标蛋白（Prey）的融合蛋白。
目录
一、实验耗材和试剂························ 2
二、实验方法···································· 3
2.1 共转化···································· 3
2.2 阳性克隆鉴定(选做)················· 3
2.3 互作检测································ 3
三、 互作验证分析····························· 4
3.1 互作/无互作······························4
3.2 Bait 蛋白有自激活·····················4
3.3 Prey 蛋白有毒性························ 4
四、注意事项····························· 5
一、实验耗材和试剂
本试剂盒提供的产品以产品组成为准，部分试剂和耗材需要自备，也可以在本公司单独购买。
1. 灭菌的枪头（1000μL、200μL、10μL）、涂布棒或玻璃珠，Φ90 mm 培养皿，备用。
2. Carrier DNA 在 95-100℃水浴 5 min，后快速冰浴，可再重复一次，备用。
3. 普通平板制备：
将 1 条培养基倒入 0.5L 去离子水中，无需调节 pH 值，高压灭菌（如，121℃灭菌 15min）。液体培养基 4℃保存备用：固体培养基，按照 20-25mL/块倒平板(Φ90mm)，凝固后放入 4℃冰箱保存。
4. 特殊平板制备：
SD/-Ade/-His/-Leu/-Trpwith Agar（X-a-gal）：将一袋 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp with Agar 培养基溶于500 mL 去离子水，无需调节 pH 值，高压灭菌（如，121℃灭菌 15min），冷却至 50℃左右，每 25mL固体培养基加入 25-50μL X-a-gal 母液，倒平板（25mL/块，Φ90 mm），凝固后于 4℃冰箱保存。
SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp with Agar（3-AT+X-a-gal）：将一袋 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp with Agar 培养基溶于 500mL 去离子水，无需调节 pH 值，高压灭菌（如，121℃灭菌 15min），冷却至 50℃左右，每 25mL体培养基加入 25-50μL X-a-gal 母液，3-AT 按照表 1 加入，混匀倒平板 25mL/块（Φ90 mm），凝固后于4℃冰箱保存。
表1不同浓度3-AT平板
培养基体积(mL)
25
25
25
25
25
25
3-AT(2.5M)加入量(μL)
50
100
300
500
800
1000
3-AT终浓度(mM)
5
10
30
50
80
100
二、实验方法
双杂实验方案较多,本公司根据多年经验，给出一个较优的点板互作验证实验方案，我们将蛋白表达，自激活检测，毒性验证放在互作检测之后（本方案不作分析）。我们假设载体构建已完成，互作验证分为三个步骤:共转化，阳性克隆鉴定（选做），互作检测。本方案还对常见互作验证结果进行了分析。
2.1 共转化
1. 取 100μL 冰上融化的 AH109 感受态细胞，依次加入预冷的质粒 pGBKT7（2-5μg，约 5μL），pGADT7（2-5μg,约 5μL），Carrier DNA 5μL（95-100℃，5min，快速冰浴，重复一次），PEG/LiAc 500μL 并吸打几次混匀，30℃水浴 30 min （15 min 时翻转 6-8 次混匀）。
2. 将管放 42°C 水浴 15 min（7.5 min 时翻转 6-8 次混匀）。
3. 10,000 rpm 离心 30s 弃上清，ddH2O400μL 重悬，离心 30s 弃上清。
4. ddH2O 50μL 重悬，涂板 SD/-Leu/-Trp 平板，28-30C 培养 48-96 h。
注: 按表 1，将各质粒转入酵母 AH109 感受态细胞中。
表1酵母转化反应
BD plasmid
AD plasmid
培养基
备注
pGBKT7-p53
pGADT7-T
SD/-Leu/-Trp
阳性对照
pGBKT7-Lam
pGADT7-T
SD/-Leu/-Trp
阴性对照
pGBKT7-Bait1
pGADT7-Preyl
SD/-Leu/-Trp
实验组1
pGBKT7-Bait1
pGADT7
SD/-Leu/-Trp
对照组1*
pGBKT7-Bait2
pGADT7-Prey2
SD/-Leu/-Trp
实验组2
pGBKT7-Bait2
pGADT7
SD/-Leu/-Trp
对照组2*
注: 对照组 1*和 2*可以更好的体现实验组是否有互作。
2.2 阳性克隆鉴定（选做）
此步骤可以省略。详细步骤可参考 PY1057-1ml-AD 2×Yeast direct PCR Mix（for pGADT7）、PY1057-1ml-BD 2×Yeast direct PCR Mix（for pGBKT7），本试剂盒分别包含猎物 AD、诱饵 BD 引物，
可直接使用。
2.3 互作检测
1. 每个样品挑取新鲜单克隆（2-3mm）于 1mL ddH2O 无菌水中重悬，OD600 调至 0.2（也可以用 SD/-Leu/-Trp液体培养基培养至 OD600=0.2）。
2. 用 ddH₂O 依次稀释 10 倍，100 倍，1000 倍（即 OD600=0.2、0.02、0.002、0.0002）。
3. 按照先实验组后对照组的顺序，分别点 10μL 菌悬液于 SD/-Leu/-Trp、SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-a-gal平板（如果已知自激活浓度，需加入 3-AT），28-30℃培养 3-5 d。
三、 互作验证分析
3.1 互作/无互作
由图 2 可知，对照组 AH109[pGBKT7-53&pGADT7-T]和 AH109[pGBKT7-Lam&pGADT7-T]在SD/-Leu/-Trp 板上长势相同：AH109[pGBKT7-53&pGADT7-T]在 SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-a-gal 板上显蓝色，且长势同 SD/-Leu/-Trp 板：而 AH109[pGBKT7-Lam&pGADT7-T]在 SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-a-gal 板上不生长且不显色，所以，pGBKT7-53 与 pGADT7-T 有互作，pGBKT7-Lam 与 pGADT7-T 无互作。
同理，pGBKT7-Bait1 与 pGADT7-Prey1 有互作,pGBKT7-Bait1 与 pGADT7 无互作（即 pGBKT7-Bait1无自激活）。
3.2 Bait 蛋白有自激活
AH109[pGBKT7-Bait2&pGADT7-Prey2]和 AH109[pGBKT7-Bait2&pGADT7]，在
SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-a-gal 板上显蓝色，且长势同 SD/-Leu/-Trp 板，所以 pGBKT7-Bait2 具有自激活。
解决自激活：在 SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-a-gal 板中加入梯度浓度的 3-AT（10、30、50、70、90mM），重做互作验证实验即可。
3.3 Prey 蛋白有毒性
SD/-Leu/-Trp 平板上 AH109[pGBKT7-Bait3&pGADT7-Prey3]长势明显弱于
AH109[pGBKT7-Bait3&pGADT7]但是在 SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-a-gal 板上
AH109[pGBKT7-Bait3&pGADT7-Prey3]能够显蓝色（虽然长势弱），AH109[pGBKT7-Bait3&pGADT7]不
能生长或生长较弱，同样能够证明 pGBKT7-Bait3 与 pGADT7-Prey3 有互作，pGBKT7-Bait3 与 pGADT7无互作（即 pGBKT7-Bait3 无自激活)。
四、注意事项
载体注意事项：
1. 建议收到质粒后请先转化感受态（克隆菌株），再挑选单菌落重新提取后使用。
2. 转化前请准确查找该质粒对应的抗生素、抗生素浓度、感受态（克隆菌株）和培养温度。
3. 如有必要请测序后使用，我司网站检索对应货号可下载质粒图谱。
培养基注意事项：
1. 华 越洋酵母缺陷培养基 pH 值已调节至 5.8，可直接使用。
2. SD 培养基可能溶解不彻底或灭菌后有少量沉淀，不影响实验进行。
3. SD 培养基灭菌后，颜色为白色至浅黄色。
感受态注意事项：
1. 一支感受态不建议分成两份使用。
2. 如果转化效率低，只有几个单克隆，建议做 PCR 鉴定。
3. 筛选出来的单克隆，一般是圆形凸起、边缘整齐、表面光滑湿润、不透明、乳白色-浅黄-浅粉色的菌落，
有酵母气味。
本试剂盒注意事项：
1. 本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗，食品及化妆品等用途。
2. 为了您的安全和健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。
3. 请注意无菌操作，避免微生物污染。
4. 此方案仅供参考。
