Ruby 可视化转录因子与 DNA 结合验证试剂盒

Ruby 可视化转录因子与 DNA 结合验证试剂盒

产品货号: hyypb2194

储存条件: 请按产品包装要求储存

注：载体构建相关试剂需自备。

Ruby 可视化转录因子与 DNA 结合验证试剂盒

产品简介:

Ruby：ruby 报告系统可表达 3 个酶蛋白（CYP76AD1，DODA、GT），三个酶蛋白将底物酪氨酸分

解形成肉眼可见的玫红色的甜菜红素。对于双荧光素酶报告系统（Dual-LUC），需要添加底物与使用化学 发光酶标仪检测其表达量。而酪氨酸作为植物的天然底物不需要人为添加底物，即可原位显色。

uvGFP：uvGFP 在 365nm 激发光源下可产生肉眼可见的绿色荧光，该荧光比 eGFP 强几十倍，观察时无需滤光片。

将待验证的 DNA 序列构建在 ruby（uvGFP 此时就作为内参，由强启动子启动表达）或者 uvGFP（ruby此时作为内参，由强启动子启动表达）报告基因的上游，利用 pGreenll62-SK 载体表达转录因子。若转录因子与 DNA 结合，将启动下游报告基因的表达，通过观察颜色（ruby 表达产生红色）或者荧光（uvGFP表达产生绿色荧光），检查其是否互做。此系统主要用于定性分析。

注意事项:

1.本产品提供了荧光素酶报告基因实验的方案，具体操作可根据自己试验的实际情况对相关内容进行调整。

2.本产品不提供的感受态及其它试剂可以在本司单独购买。

3.虽然本产品操作步骤以烟草为例，但实际可尝试应用于更多荧光素酶报告基因受体植物。

4.质粒建议重新转化大肠杆菌扩繁，提取质粒后使用。

使用说明（仅供参考）：

一、载体构建

将所研究的启动子序列构建到 62SK-uvGFP-no-pro-Ruby 载体 MCS 区（卡那抗性）；将所研究的目标蛋白的 CDS 序列构建到 pGreenII 62-SK 载体 MCS 区（卡那抗性）。

Ruby 可视化转录因子与 DNA 结合验证试剂盒

二、烟草注射

1. 转化农杆菌：

将 pGreenll62-SK-TF、62SK-uvGFP-genepro-Ruby、pGreenll 62-SK-GAL4-VP16、62-SK-5xUAS-ruby、

pGreenll 62-SK 分别转化农杆菌感受态细胞 GV3101（psoup-p19），涂布 YEB 平板（50μg/mL Kan、10μg/mLRif），28℃培养 3 天。

2. 鉴定及摇菌：

鉴定目的基因阳性克隆，并挑取单菌落于 3mL 的 YEB 培养基中（含 50μg/mL Kan 和 10μg/mL Rif），

过夜培养 14-18 h。

3. 配制 Activation Buffer：

在无菌条件下，用 ddH2O 将 5×农杆菌侵染液稀释为 l×工作液，每 10mL 工作液加入 10μL 乙酰丁香酮（100 mM）混匀，即为 Activation Buffer，备用。

注：Activation Buffer 需要现配现用，根据第 2 步菌液的体积配置合适体积的 Activation Buffer。

4. 收集、重悬菌体：

取 2mL 摇至浑浊的农杆菌菌液（OD600=1.0~1.5），5000 rpm 离心 10min，弃去上清，用 Activation Buffer重悬菌体，调至 OD600=0.8。

5. 混菌：

实验组按照下表 1:1 体积混合两种菌体，黑暗下静置 2-4h。

Ruby 可视化转录因子与 DNA 结合验证试剂盒

6. 注射法侵染烟草叶片：

使用 1mL 无菌注射器吸取上一步得到的重悬液，避开烟草叶脉，确认要注射的区域，先用注射器

针头在要注射的区域边缘轻微划一下，造成“微创”，注意不要划破叶片，左手抵在叶片的正面，右手将注射器（不带针头）垂直压在叶片的背面，右手拇指慢慢推压注射器，观察菌液在表皮下扩散到一定范围（具体范围视烟草叶片大小而定，若多组注射在同一叶片时，务必使扩散范围互不影响）。注射完于温室中暗培养 48-72h，根据实验需求进行后续实验。

同一株烟草选取 2-3 个叶片进行注射。同一批试验建议至少注射 3 株烟草。

注：最好选择 4-5 周龄健康的本氏烟进行注射（太小的叶片不容易注射，太老的叶片表达效率较低），

如注射范围较大，需额外多配制菌液。

三、结果

首先查看 365nm 灯照下四个组注射点的 uvGFP 内参是否正常表达荧光，若正常显色表明瞬时转化成功。

有互做：空白对照组 ruby 未表达，实验组 ruby 表达，显示红色，内参 uvGFP 显示绿色荧光。

无互做：空白对照组和实验组内参 uvGFP 显示绿色荧光，报告基因 ruby 不显色。

有自激活：空白对照组和实验组 ruby 都有表达，显示红色，内参 uvGFP 显示绿色荧光。

注：实验中会发现 Ruby 表达量高时，玫红色很深，此时 uvGFP 显色浅，是正常现象，uvGFP 需要从烟草叶片背面观察。

注射后大约 5-7 天观察为佳，因为 uvGFP 显色慢于 ruby，时间短 uvGFP 显色不强。时间长则 ruby 本底表

达会过多积累。

阴性/自激活组的 Ruby，在时间超过 6 天，会有一点轻微的本底表达显色，但其颜色显著低于阳性组，此为正常现象。

具体最佳显色时间与每一次的实验细节与烟草状态决定，可以在 4 天后，每天观察

下图为例：注射后 7 天观察（左图为明场观察，右图为 365nm 紫外激发下观察）

左上：实验组，显色明显，蛋白 A 与 B 有互作。

左下：空白对照组，有轻微的红色，本底表达正常现象。

右上：阳性组，因为 ruby 表达的色素太深，导致 uvGFP 显色不强。

右下：阴性对照组，有轻微的红色，本底表达正常现象

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