Ruby 可视化蛋白互作验证试剂盒
产品简介:
Gal4-VP16-UAS 系统：Gal4-VP16 融合蛋白（Gal4：结合域，VP16：激活域）能够结合 UAS 序列元件，启动下游报告基因表达。将两个结构域分开表达，若两个结构域能在空间上接近，则形成完整蛋白，结合 UAS 并激活下游报告基因表达。
Ruby：ruby 报告系统可表达 3 个酶蛋白（CYP76AD1 、DODA 、GT），三个酶蛋白将底物酪氨酸分解形成肉眼可见的玫红色的甜菜红素。而酪氨酸作为植物的天然底物不需要人为添加底物，即可原位显色。
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Ruby 可视化蛋白互作验证试剂盒
货号：Hyybp8105 规格：1Set
储存条件: 请按产品包装要求储存
产品组分:
产品名称
规格
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pGreenll 62-SK-GAL4
10μl 质粒
-20℃
pGreenll 62-SK-VP16
10μl 质粒
-20℃
62-SK-5xUAS-ruby
10μl 质粒
-20℃
pGreenll 62-SK-GAL4-VP16
10μl 质粒
-20℃
5×农杆菌侵染液
80ml
4℃
365nm 紫外手电筒
个
常温
说明书
1份
注：载体构建相关试剂需自备。
产品简介:
Gal4-VP16-UAS 系统：Gal4-VP16 融合蛋白（Gal4：结合域，VP16：激活域）能够结合 UAS 序列元件，启动下游报告基因表达。将两个结构域分开表达，若两个结构域能在空间上接近，则形成完整蛋白，结合 UAS 并激活下游报告基因表达。
Ruby：ruby 报告系统可表达 3 个酶蛋白（CYP76AD1 、DODA 、GT），三个酶蛋白将底物酪氨酸分解形成肉眼可见的玫红色的甜菜红素。而酪氨酸作为植物的天然底物不需要人为添加底物，即可原位显色。
uvGFP：uvGFP 在 365nm激发光源下可产生肉眼可见的绿色荧光，该荧光比 eGFP 强几十倍，观察时无需滤光片。
互作验证：ruby 报告基因前面构建有 5xUAS 序列。将蛋白A 与Gal4 融合表达，蛋白 B 与 VP16 融合表达，若 A 与 B 能形成互作，拉近 Gal4-VP16 形成完整蛋白，结合到 5xUAS 序列上，启动下游ruby 基因表达，形成肉眼可见的玫红色色素。此外，报告载体上面还有uvGFP 表达框。uvGFP 基因前面为组成性强启动子，可作为内参，用于参考瞬时转化是否成功。
Ruby 可视化蛋白互作验证试剂盒
使用说明(仅供参考）：
一、载体构建
将所研究的两个目标蛋白（蛋白 A 、蛋白B）的 CDS 序列分别构建到 pGreenll 62-SK-GAL4 载体（卡那抗性）的 GAL4 区域的下游 MCS 处和 pGreenll 62-SK-VP16 载体（卡那抗性）的 VP16 区域的下游 MCS处，即为 pGreenll 62-SK-GAL4-蛋白 A 、pGreenll 62-SK-VP16-蛋白 B。
注：1. 载体构建时插入片段与GAL4 或 VP16 要保持同一阅读框，保证插入片段融合表达。
2. 该对载体的 MCS 在 GAL4/VP16 的 C 端，构建时需要保留止密码子。
载体
同源臂
鉴定引物
酶切位点
pGreenll
62-SK-GAL4
F：CGGCCGCTCTAGAACTAGTG
F：GTCACAGATAGATTGGCTTC
SpeI
R：GTCGACGGTATCGATAAGCTT
R：GCTCAACACATGAGCGAAAC
HindIII
pGreenll
62-SK-VP16
F：CGGCCGCTCTAGAACTAGTG
F：ACGATTTCGATCTGGACATG
SpeI
R：GTCGACGGTATCGATAAGCTT
R：GCTCAACACATGAGCGAAAC
HindIII
二、烟草注射
1. 转化农杆菌：
将 pGreenll 62-SK-GAL4-蛋白 1 、pGreenll 62-SK-VP16-蛋白 2 、pGreenll 62-SK-GAL4 、pGreenll
62-SK-VP16 、62-SK-5xUAS-ruby 、pGreenll 62-SK-GAL4-VP16 分别转化农杆菌感受态细胞 GV3101 （psoup-p19），涂布 YEB 平板（50μg/mL Kan 、10μg/mL Rif），28℃培养 3 天。
2. 鉴定及摇菌：
鉴定目的基因阳性克隆，并挑取单菌落于 3mL 的 YEB 培养基中（含 50μg/mL Kan 和 10μg/mL Rif），过夜培养 14- 18 h。
3. 配制 Activation Buffer：
在无菌条件下，用 ddH2O 将 5×农杆菌侵染液稀释为 l×工作液，每 10mL 工作液加入 10μL 乙酰丁香酮（100 mM）混匀，即为 Activation Buffer ，备用。
注：Activation Buffer 需要现配现用，根据第 2 步菌液的体积配置合适体积的 Activation Buffer。
4. 收集、重悬菌体：
取 2mL 摇至浑浊的农杆菌菌液（OD600= 1.0~ 1.5），5000 rpm 离心 10min，弃去上清，用 Activation Buffer重悬菌体，调至 OD600=0.8。
5. 混菌：
实验组按照下表 1:1:1 体积混合两种菌体，黑暗下静置 2-4h 。（阳性对照组合与实验组相同，不再赘述。）
阳性组
pGreenll 62-SK-GAL4-VP16
/
62-SK-5xUAS-ruby
实验组
pGreenll 62-SK-GAL4-蛋白 1
pGreenll 62-SK-VP16-蛋白 2
62-SK-5xUAS-ruby
自激活组 1
pGreenll 62-SK-GAL4-蛋白 1
pGreenll 62-SK-VP16
62-SK-5xUAS-ruby
自激活组 2
pGreenll 62-SK-GAL4
pGreenll 62-SK-VP16-蛋白 2
62-SK-5xUAS-ruby
6. 注射法侵染烟草叶片：
使用 1mL 无菌注射器吸取上一步得到的重悬液，避开烟草叶脉，确认要注射的区域，先用注射器针头在要注射的区域边缘轻微划一下，造成“微创” ，注意不要划破叶片，左手抵在叶片的正面，右手将注射器（不带针头）垂直压在叶片的背面，右手拇指慢慢推压注射器，观察菌液在表皮下扩散到一定范围（具体范围视烟草叶片大小而定，若多组注射在同一叶片时，务必使扩散范围互不影响）。注射完于温室中暗培养 48-72h ，根据实验需求进行后续实验。
同一株烟草选取 2-3 个叶片进行注射。同一批试验建议至少注射 3 株烟草。
注：最好选择 4-5 周龄健康的本氏烟进行注射（太小的叶片不容易注射，太老的叶片表达效率较低）
如注射范围较大，需额外多配制菌液。
Ruby 可视化蛋白互作验证试剂盒
三、结果观察
首先查看 365nm灯照下四个组注射点的 uvGFP 内参是否正常表达荧光，若正常显色表明瞬时转化成功。
有互作：实验组ruby 表达，显示红色， 内参 uvGFP 显示绿色荧光。
无互作：实验组内参 uvGFP 显示绿色荧光，报告基因ruby 不显色。
无自激活（两个自激活组的ruby 不显色）。
有自激活（两个自激活组的ruby 显色）。
将蛋白A 与蛋白B 互换构建，即：蛋白A 与 VP16 融合。蛋白 B 与 Gal4 融合。
注：实验中会发现 Ruby 表达量高时，玫红色很深，此时 uvGFP 显色浅，是正常现象，uvGFP 需要从烟草叶片背面观察。
注射后大约 5-7 天观察为佳，因为uvGFP 显色慢于ruby ，时间短 uvGFP 显色不强。时间长则ruby 本底表达会过多积累。
阴性/自激活组的 Ruby ，在时间超过 6 天，会有一点轻微的本底表达显色，但其颜色显著低于阳性组，此为正常现象。
具体最佳显色时间与每一次的实验细节与烟草状态决定，可以在 4 天后，每天观察。
下图为例：注射后 7 天观察（左图为明场观察，右图为 365nm 紫外激发下观察）
左上：实验组，显色明显，蛋白A 与 B 有互作。
右上：阳性组，因为ruby 表达的色素太深，导致 uvGFP 显色不强。
左下： 自激活组 1 ，有轻微的红色，本底表达正常现象。
右下： 自激活组 2 ，有轻微的红色，本底表达正常现象。
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