β-半乳糖苷酶(β-GAL)检测试剂盒（ONPG 法）
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β-半乳糖苷酶(β-GAL)检测试剂盒（ONPG 法）
hyykb63-50T
产品内容：
产品组分
规格（50 T）
储存温度
A 液（提取液）
10 mL
RT
玻璃珠(φ425-600 μm, Acid washed）
5 g
RT
ONPG（4 mg/mL）
1.7 mL×6
-20℃
B 液（缓冲液）
30 mL
-20℃
C 液（终止液）
75 mL
RT
运输及储存条件：
蓝冰运输；各组分按照产品内容表中所示温度储存，保质期 18 个月。
β-半乳糖苷酶(β-GAL)检测试剂盒（ONPG 法）
产品介绍:
LacZ 是一种细菌基因，在真核转染实验中经常被用作报告基因构建建体，其蛋白产物 β-半乳 糖苷酶 (β-GAL）性质稳定，活性容易测定。β-半乳糖苷酶能够催化无色的ONPG 水解生成 黄色的 ONP ，ONP 在 420 nm 波长下具有最大吸收峰。
本试剂盒采用经典的 ONPG 底物成色法，通过对样品420 nm 波长下的吸光度的测定，可获 得 β-GAL 的相对活性。实验操作简单，结果稳定。
操作步骤：
一、准备工作
1.样品准备
1. 细菌/细胞样本准备：收集 1-2 mL（＞107 个）细菌或细胞到离心管内，12,000 rpm，4℃离 心 5 min，弃上清收集细胞沉淀。
2. 组织样本准备：将组织液氮研磨成粉末状，称取约 20-60 mg 粉末置于冰上待用。
3. 液体样本准备：澄清的液体直接检测；若浑浊则离心后取上清检测。
2.需要自行准备的试剂
Bradford 蛋白浓度测定试剂盒。
β-半乳糖苷酶(β-GAL)检测试剂盒（ONPG 法）
二、蛋白提取
1. 用 100 μL 预冷 A 液（提取液）悬浮沉淀，并快速转移到 1.5 mL 离心管中。
2. 加入 0.05 g 的玻璃珠，在旋涡震荡器上剧烈震荡混合 5-10 min（间歇冰浴冷却）。
3. 用移液器或者巴斯德吸管回收提取液。
4. 再加入 100 μL 预冷 A 液（提取液）到剩余的玻璃珠中，稍加震荡，再次回收提取液。
5. 合并两次所得提取液即为总蛋白样品。
6. 12,000 rpm，4℃ 离心 15 min，取上清。提取总蛋白样品直接用于后续活性检测实验或-80℃ 保存备用。
7. 使用自备的 Bradford 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。
三、样品测定
1. 酶标仪/分光光度计预热 30 min 以上，温度设定 37℃,调节波长至 420 nm。
2. 在离心管中按照下边依次加入：
组分
测定组 对照组
空白组
第一步
总蛋白
V V
-
ONPG
70μL -
70 μL
去离子水
补足至 100 μL 补足至 100 μL
30 μL
第二步
B 液（缓冲液）
200μL 200 μL
200 μL
第三步
混匀后 37℃静置 30 min
第四步
C 液（终止液）
500μL 500 μL
500 μL
第五步 混匀后进行步骤 3 吸光值测定
注：需要测定至少三种不同体积的总蛋白样品，即 V 为 10 、20 和 30 μL。吸光度的变化应与 测定的蛋白样品量成线性关系。如果不是，将无法得到准确的测定结果。
3. 吸光值测定
步骤 2 中混匀后，置于 420 nm 波长的酶标仪/分光光度计中测量吸光值 A。空白组调零。 ΔA=A(测定)-A(对照)
注 1 ：每个测定管需设一个对照管。
注 2 ：若 ΔA 过小，可以延长保温时间，如 40 min 或更长，或增加蛋白样本上样量 V（去离 子水相应减少），改变后的 T 或 V 需重新代入计算公式计算。
四、活性计算
酶活定义：每毫克蛋白每分钟水解 1 nmol ONPG 生成 ONP 定义为 1 个酶活单位。
1. 无标准品蛋白活性计算方法：
β-GAL 活性= nmoles of ONPG hydrolyzed/t/mg protein
注：4500 为消光系数，T 为反应时间，V 为加入蛋白体积，Cpr 为蛋白浓度。
2. 自备标准品蛋白活性计算方法：
1）建立标准浓度 ONP 标准曲线方程。
2）将步骤三中检测吸光值代入标准曲线方程，得到 ONP 浓度。
3）β-GAL 活性计算：
β-GAL 活性=nmoles ofONPG hydrolyzed/t/mg protein
= ONP 物质的量÷T ÷(V × Cpr)
注：T 为反应时间，V 为加入蛋白体积，Cpr 为蛋白浓度。
β-半乳糖苷酶(β-GAL)检测试剂盒（ONPG 法）
注意事项：
1. 本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗，食品及化妆品等用途。
2. 为了您的安全和健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。
