化学发光法EMSA试剂盒

化学发光法EMSA试剂盒

Hyybyb-100T

1. 探针的标记：

可以直接选购生物素标记EMSA探针，或使用EMSA探针生物素标记试剂盒或其它合适的试剂盒进行EMSA探针的生物素标记。

化学发光法EMSA试剂盒

2. 探针的纯化和检测：

本公司的各种生物素标记EMSA探针都已经过纯化，可以直接使用；对于使用EMSA探针生物素标记试剂盒等试剂盒标记的EMSA探针，通常 为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。有些时候，纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果。详细的探针纯化和探针的标记效率的检测请参考EMSA探针生物素标记试剂盒的相关说明。
3. EMSA胶的配制：
a.准备好倒胶的模具。可以使用常规的制备蛋白电泳胶的模具(例如BioRad的常规用于蛋白电泳的制胶装置)，或其它适当的模具。最好选择可以灌制较薄 胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以选择可灌制较大EMSA胶的模具。制胶前必须把制胶模具冲洗干净，需特别注意不能有SDS残留。
b.按照如下配方配制20ml 4%的聚丙烯酰胺凝胶(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。

c.按照上述顺序依次加入各种试剂，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡，并加上梳 齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。
4. EMSA结合反应：
a.如下设置EMSA结合反应：

b.按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，并且室温(20-25℃)放置10分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的 非特异性结合，或者让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针，混匀，室温(20-25℃)放置20分钟。
c.加入1μl EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)，混 匀后立即上样。注意：有些时候溴 酚蓝会影响蛋白和DNA的结合，建议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样，可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液，至可以观察到蓝颜色即可。
5.电泳：
a.用0.5XTBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔，可以加入少量稀释 好的1X的EMSA上样缓冲液(蓝色)，以观察电压是否正常进行。
b.把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10μl稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色)，用于观察电泳进行的情况。
c.按照10V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30℃，如果温度升高，需要适当降低电压。电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。
6. 转膜：
a.取一和EMSA胶大小相近或略大的尼龙膜，剪角做好标记，用0.5XTBE浸泡至少10分钟。尼龙膜自始至终仅能使用镊子夹取，并且仅可夹取不可能接触样品的边角处。
b.取两片和尼龙膜大小相近或略大的滤纸，用0.5XTBE浸湿。
c.把浸泡过的尼龙膜放置在一片浸湿的滤纸上，注意避免尼龙膜和滤纸间产生气泡。
d.非常小心地取出EMSA胶放置到尼龙膜上，注意确保胶和膜之间没有气泡。
e.再把另外一片浸湿的滤纸放置到EMSA胶上，注意确保滤纸和胶之间没有气泡。
f.采用Western时所使用的湿法电转膜装置或其它类似的电转膜装置，以0.5XTBE为转膜液，把EMSA胶上的探针、蛋白以及探针和蛋白的复合物等转移到尼龙膜上。对于大小约为10x8x0.1cm的EMSA胶，用BioRad的常用的Western转膜装置，电转时可以设置为380mA(约100V)转膜30-60分钟。如果胶较厚，则需适当延长转膜时间。转膜时需保持转膜液的温度较低，通常可以把电转槽置于4℃冷库或置于冰浴或冰水浴中进行电转，这样可以确保低温。具体的电转膜方法请参考电转膜装置的使用说明。
g.转膜完毕后，小心取出尼龙膜，样品面向上，放置在一干燥的滤纸上，轻轻吸掉下表面明显的液体。立即进入下一步的交联步骤，不可使膜干掉。
7. 交联：
a.用紫外交联仪(UV-light cross-linker)选择254nm紫外波长，120mJ/cm2，交联45-60秒。如果没有紫外交联仪可以使用普通的手提式紫外灯，距离膜5-10厘米左右照射3-10分钟。也可以使用超净工作台内的紫外灯，距离膜5-10厘米左右照射3-15分钟。最佳的交联时间可以使用标准品自行摸索。
b.交联完毕后，可以直接进入下一步检测；也可以用保鲜膜包裹后在室温干燥处存放3-5天，然后再进入下一步检测。如果检测结果发现交联效果不佳，甚至连free probe的条带都非常微弱，可以考虑在膜干燥后参考步骤A的条件再交联一次，以进一步改善交联效果。
8. 化学发光法检测生物素标记的探针：
a.37-50℃水浴溶解封闭液和洗涤液。注意： 封闭液和洗涤液必须完全溶解后方可使用，封闭液和洗涤液可以在室温至50℃之间使用，但必须确保这两种溶液中均无沉淀产生，在冬天需特别注意。
b.取一合适的容器加入15ml封闭液，再放入交联过的含有样品的尼龙膜。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。
c.取7.5μl Streptavidin-HRP Conjugate加入到15ml封闭液中(1:2000稀释)，混匀备用。
d.去除用于尼龙膜封闭的封闭液，加入上一步中配制的15ml含有Streptavidin-HRP Conjugate的封闭液。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。
e.取25ml洗涤液(5X)，加入100ml重蒸水或Milli-Q级纯水，混匀配制成125ml洗涤液。
f.将尼龙膜转移至另一装有15-20ml洗涤液的容器内，漂洗1分钟。
g.去除洗涤液，加入15-20ml洗涤液，在侧摆摇床或水平摇床缓慢上洗涤5分钟。
h.重复步骤G 三次(共洗涤四次)，每次洗涤时间都约为5分钟。
i.将尼龙膜转移至另一装有20-25ml检测平衡液的容器内，在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动5分钟。
j.取5ml  ECL Moon A液和5ml  ECL Moon B液混匀，配制成 ECL Moon工作液。
化学发光法EMSA试剂盒

注意： ECL Moon工作液必须现配现用。

说明：从本步骤起操作方法和注意事项同Western实验的荧光检测。
.取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。立即将膜的样品面向上，放置到处于水平桌面上的洁净容器内或保鲜膜上。
在尼龙膜的表面小心加上步骤J配制好的共10ml  ECL Moon工作液，使工作液完全覆盖尼龙膜。室温放置2-3分钟。
.取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。将尼龙膜放在两片保鲜膜或其它适当的透光薄膜中间，并固定于压片暗盒(也称片夹)内。
.用X光片压片1-5分钟。可以先压片1分钟，立即显影定影，然后根据结果再调整压片时间；也可以直接分别压片30秒、1、3、5分钟或更长时间，然后一起显影定影观察结果。