烟草叶片信号肽检测试剂盒
-
烟草叶片信号肽检测试剂盒
烟草叶片信号肽检测试剂盒储存条件:
请按产品包装要求储存，有效期一年。
Hyypb842
产品组分:
Component
类型
规格
Store
5×农杆菌侵染液
溶液
80ml
4℃
乙酰丁香酮(100 mM)
溶液
400μl
-20℃ , 避光
pSuper1300-Avr3a-C
空载质粒
10μl 质粒
-20℃
pSuper1300-R3a
空载质粒
10μl 质粒
-20℃
pSuper1300-Avr1bsignal-Avr3a-C
对照质粒
10μl 质粒
-20℃
烟草叶片信号肽检测试剂盒产品简介:
分泌蛋白指的是在细胞内合成，能够分泌到细胞外发挥作用的蛋白质。信号肽位于分泌蛋白的 n 端， 一般由 15-30 个氨基酸组成。当信号肽序列合成后，被信号识别颗粒所识别，蛋白质合成暂停或减缓，信 号识别颗粒将核糖体携带至内质网上，蛋白质合成重新开始。在信号肽的引导下，新合成的蛋白质进入内 质网腔，最终被转移到细胞外，信号肽则被切除。本试剂盒采用卵菌中致病疫霉的无毒效应蛋白avr3a 和 寄主中对应的马铃薯抗病基因 R3a，R3a 在植物细胞内可以识别 Avr3a ，引起细胞坏死。当 Avr3a 被融合表 达的信号肽分泌到植物细胞外时，则不能被 R3a 识别，从而不能引起细胞坏死。
产品特点:
1. 本试剂盒提供了检测用到的 3 个质粒。
2. 提供了在烟草叶片中检测信号肽分泌功能检测的方案。检测系统灵敏高效，应用范围广。
3. 优化了实验体系。提供了阳性对照质粒，控制更准确，操作更简便。
注意事项:
1. 本产品提供了在烟草叶片中检测信号肽分泌功能的实验方案，方案不唯一，可根据文献记录及自己实验 的实际情况对相关内容进行调整。
2. 第一次使用本产品质粒时，请重新转化大肠杆菌克隆菌株(如 DH5a)扩繁，提取质粒后使用。
3. 实验方案中所涉及到的试剂产品均可在本司购买，详情登录本司官网查询。
4. 本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗、食品及化妆品等用途。
烟草叶片信号肽检测试剂盒
操作步骤:（在开始操作前请先阅读注意事项）
一、载体构建
将所研究的信号肽碱基序列构建到 pSuper1300-Avr3a-C（MCS）载体(卡那抗性)的 Avr3a-C 区域的上 游 MCS 处，即为 pSuper1300-signal-Avr3a-C。
注：1. 载体构建时插入片段与 Avr3a-C 要保持同一阅读框，保证插入片段融合表达。
2. 该载体的 MCS 在 Avr3a-C 的 N 端，构建时需要去掉终止密码子。
3. 该对载体鉴定通用引物 [P1：ACACGCCAAGCCTCGCTA ，P2：ATGCAGCATCCGCCAGCTT]
载体
同源臂
酶切位点
ppSuper1300-signal-Avr3a-C
F:CGATACACCAAATCGACTCTAGA
XbaI
R:GAAATTTGGGGCCATGTCGAC
SalI
二、瞬时转化
1. 转化农杆菌：
将 pSuper1300-Avr3a-C 、pSuper1300-Avr1bsignal-Avr3a-C 、pSuper1300-signal-Avr3a-C 、pSuper1300-R3a 分别转化农杆菌感受态细胞 GV3101 ，涂布 YEB 平板（50μg/mL Kan 、10μg/mL Rif），28℃培养 3 天。
2. 鉴定及摇菌：
鉴定目的基因阳性克隆，并挑取单菌落于 3mL 的 YEB 培养基中(含 50μg/mL Kan 和 10μg/mL Rif)，过夜 培养 14-18 h。
3. 配制 Activation Buffer：
在无菌条件下，用 ddH2O 将 5×农杆菌侵染液稀释为 l×工作液，每 10mL 工作液加入 10μL 乙酰丁香酮 (100 mM)混匀，即为 Activation Buffer ，备用。
注: Activation Buffer 需要现配现用，根据第 2 步菌液的体积配置合适体积的 Activation Buffer。
4. 收集、重悬菌体：
取 2mL 摇至浑浊的农杆菌菌液(OD600= 1.0~ 1.5) ，5000 rpm 离心 10min ，弃去上清，用 Activation Buffer 重悬菌体，调至 OD600=0.8。
5. 混菌：
实验组按照下表 1:1 体积混合两种菌体，黑暗下静置 2-4h 。（阳性对照组合与实验组相同，不再赘述。）
组 1
pSuper1300-Avr3a-C
pSuper1300-R3a
组 2
pSuper1300-Avr1bsignal-Avr3a-C
pSuper1300-R3a
组 3
pSuper1300-signal-Avr3a-C
pSuper1300-R3a
6. 注射法侵染烟草叶片：
使用 1mL 无菌注射器吸取上一步得到的重悬液，避开烟草叶脉，确认要注射的区域，先用注射器 针头在要注射的区域边缘轻微划一下，造成“微创” ，注意不要划破叶片，左手抵在叶片的正面，右手将 注射器(不带针头)垂直压在叶片的背面，右手拇指慢慢推压注射器，观察菌液在表皮下扩散到一定范围 （具体范围视烟草叶片大小而定，若多组注射在同一叶片时，务必使扩散范围互不影响）。注射完于温 室中暗培养 48-72h ，根据实验需求进行后续实验。
同一株烟草选取 2-3 个叶片进行注射。同一批试验建议至少注射 3 株烟草。
注：最好选择 4-5 周龄健康的本氏烟进行注射（太小的叶片不容易注射，太老的叶片表达效率较低）， 如注射范围较大，需额外多配制菌液。
烟草叶片信号肽检测试剂盒结果观察
暗培养 48-72 h 后观察烟草注射农杆菌的区域有无坏死。
