植物GUS酶活性检测试剂盒
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植物GUS酶活性检测试剂盒
HYYSB98312025
可见分光光度法
产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系华越洋工作人员。
试剂名称
规格
保存条件
提取液
液体50mlx1瓶
4℃
试剂一
粉剂x2瓶
-20℃
试剂二
液体25mlx1瓶
4℃
试剂三
液体80mlx1瓶
4℃
标准品
液体1mlx1瓶
4℃
溶液的配制:
- 试剂一:临用前每瓶加入 10mL蒸馏水，充分溶解:用不完的试剂-20分装保存4周，避免反复冻融:
- 2、标准品:5 μmol/mL 的对硝基苯酚溶液。
产品简介:
β-GC(EC 3.2.1.21)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化β-糖苷键水解，具有多方面生理作用:在纤维素的糖化作用中，β-GC负责进一步水解纤维素二糖和纤维素寡糖生成葡萄糖;β-GC水解萜烯类香气前驱体，使糖苷键合态变成游离态。从而产生香味;β-GC能够水解植物体内野黑樱苷，释放HCN，从而防止昆虫取食。
β-GC分解对-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高
速率来计算β-GC活性。
植物GUS酶活性检测试剂盒
注意:实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一.样本处理(可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献)
1、细菌或培养细胞的处理:先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清:按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议1000万细菌或细胞加入1mL,提取液)，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率 200W，超声3s，间隔10s，重复30次);15000g，4℃条件下离心20min，取上清，置冰上待测。
2、组织的处理:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约 0.2g组织，加入 1mL提取液)，进行冰浴匀浆。15000g，4℃条件下离心20min，取上清，置冰上待测。
二、测定步骤
1.分光光度计预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。
2.标准液的稀释:临用前将5mmolmL标准液稀释至100、50、25、12.5、6.25、0nmolmL 标准溶液待测。
3.标准液稀释可参考下表:
序号
稀释前浓度(nmol/mL)
标准液体积(μL)
蒸馏水体积(μL)
稀释后浓度(nmol/mL)
1
5000
100
400
1000
2
1000
200
1800
100
3
100
1000
1000
50
4
50
1000
1000
25
5
25
1000
1000
12.5
6
12.5
1000
1000
6.25
7
6.25
0
1000
0(空白管）
备注:下述实验中每个标准管需500uL标准溶液(注意不要在此步骤直接检测标准溶液吸光度)。
4.加样表:
试剂名称(μL)
对照管
测定管
标准管
试剂一
-
400
-
试剂二
500
500
-
样本
100
100
-
迅速混匀，放入37℃水浴锅/恒温培养箱中准确水浴30min后，立即放入沸水浴中煮沸5min(缠封口膜，防止爆盖)，流水冷却后充分混匀(以保证浓度不变)
试剂一
400
-
-
充分混匀，8000g，4℃离心5min，取上清液待测
上清液
500
500
-
标准液
-
-
500
试剂三
1000
1000
1000
充分混匀，室温静置2min后，400nm处测定吸光值A，分别记为A定、A对照、A标准、A空白。计算△A测定=A测定-A对照，△A标准=A标准-A空白。每个测定管需设一个对照管。标准曲线和空白管只需测1-2次
三、β-GC活力单位的计算
1、标准曲线建立:
根据标准管的浓度(x，nmol/mL)和吸光度(y，△A标准)，建立标准曲线。根据标准曲线，将△A(y，△A测定)带入公式计算样本产物浓度x(nmol/mL)。
2、按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
β-GC活力(U/mg prot)=(xxV反总)÷(V样xCpr)-T=20x÷Cpr
- 按样本质量计算:
单位的定义:每g组织每小时产生1nmol对-硝基苯定义为一个酶活力单位
β-GC活力(U/g 质量)=(XxV反总)÷(WxV样÷V样总)÷T=20x÷W
4、按细菌或细胞数量计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞每小时产生Inmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
β-GC活力(U/10* cell)=(xxV反总)-(1000xV样÷V样总)-÷T=0.02x
Cpr:样本蛋白质浓度，mg/mL，蛋白浓度需要另外测定;V反总:反应体系总体积，1mL;V样:加入反应体系中样本体积，0.1mL;V样总:加入提取液体积，1mL;W:样本质量，g:1000:细胞或细总数，1000万;T:反应时间，0.5h。
