Y2HGold 感受态细胞

Y2HGold 感受态细胞

Y2HGold Competent Cell

基因组：

    MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4Δ, gal80Δ,LYS2 : : GAL1UAS–Gal1TATA–His3, GAL2 UAS–Gal2TATA–Ade2 URA3 : : MEL1UAS–Mel1TATA  AUR1-C MEL1 

产品说明：

Y2HGold菌株是Clontech公司开发的GAL4系统酵母双杂实验用菌株，MATa型，可直接转化质粒或与MATα型酵母菌株Y187通过mating操作进行蛋白互作验证或筛库试验。Transformation  marker为: trp1, leu2，报告基因为：AbAr, HIS3, ADE2, MEL1。

Y2HGold -GAL4酵母双杂系统需要两种质粒配套使用：PGBKT7和PGADT7。质粒PGBKT7的筛选标志为TRP1，用于表达DNA-BD(来自酵母转录因子GAL4N端1~ 174位氨基酸)与目标蛋白(Bait)的融合蛋白；质粒PGADT7的筛选标志为LEU，用于表达AD(GAL4 C端768 ~881 位氨基酸)与目标蛋白（Prey）的融合蛋白。GAL4系统原理：一个完整的酵母转录因子GAL4可分为功能上相互独立的两个结构域：位于N端1 ~ 174位氨基酸区段的DNA结合域（DNA-BD）和位于C端768 ~881 位氨基酸区段的转录激活域(AD)。DNA-BD能够识别GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS，并与之结合。而AD可以启动UAS下游的基因进行转录。BD和AD单独存在不能激活转录，但当二者接近时，则呈现完整的GAL4活性，使含有UAS的启动子下游基因转录表达。正常条件下，BD不与AD结合，将要检测的蛋白质分别与BD和AD融合，形成 bait 融合蛋白（bait -BD）和 prey 融合蛋白（prey-AD），如果 bait 和 prey发生相互作用，就会促使 BD 和 AD 的相互接近，形成完整的GAL4，从而激活报告基因的转录。

Y2HGold有四个报告基因：AbAr, HIS3, ADE2, MEL1，分别由三种不同的启动子（G1，G2，M1）启动，这三种启动子只有GAL4识别的17bp核心区相同，其余部分均不同，大大降低了酵母双杂假阳性发生的概率。此外新报告基因AbAr与以前的营养缺陷报告基因相比具有更低背景的优点，也可以降低酵母双杂假阳性发生的概率。

操作方法：

1. 取100 μl冰上融化的Y2HGold感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒1-5ug，Carrier DNA（95-100度5min,快速冰浴，重复一次）10 ul ，PEG/liAC 500ul并吸打几次混匀，30度水浴30 分钟（15 min时翻转6-8次混匀）。 

2. 将管放42度水浴15min （7.5 min时翻转6-8次混匀）。 

3. 5000 rpm 离心 40s 弃上清，ddH2O 400ul 重悬，离心 30s 弃上清。 

4. ddH2O 50ul重悬，涂板，29℃培养48-96h。

注意事项：

1. 感受态细胞最好在冰上融化。转化高浓度的质粒可减少用于涂板的菌量，同时转化2-3种质粒时应增加质粒的用量。 

2. Y2HGold酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。 

3. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被消耗完，酵 母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于 其 ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole（AIR）的积累而使菌落变为粉红色。

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